biotechnology-2012-03
.pdf
HО
Х
Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О
|
|
|
|
О |
|
Х |
||
P |
|
|
||||||
|
|
|
|
|||||
О– |
5`CH2 |
О |
1` |
|||||
|
|
|
|
4` |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3` |
|
2` |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ОН Н |
|||
= урацил: |
|
|
|
|||||
Н Н О
НС 
N Н
Н
N
О
О
Н
N Н
Н
N
О
Тимин (типичен для ДНК)
Урацил (типичен для РНК)
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) – может быть встроен в растущую цепь, как и dTTP, не нарушает комплементарности
Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
|
|
|
|
|
|
|
Н |
|
О |
UDG, 45-550С |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N Н |
|
|
|
|
О |
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
О- |
|
|
|
|
|
О |
Н |
N О |
|
||
|
P |
|
|
||||||||
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
||||||||
|
|
О– |
5`CH2 |
О |
|
|
|
|
|||
1` |
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
4` |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3` 
2`
О- Н
1) Урацил ДНК
-гликозилаза, присутствующая в ПЦР-смеси, отщепляет урацил от цепи ДНК, оставляя т.н. АР-сайт
Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
UDG, 45-550С
О |
|
|
О- P |
О |
|
О– |
5`CH2 О |
1` |
|
4` |
|
|
|
AP-сайт |
3` |
2` |
|
О- |
Н |
1) Урацил ДНК
-гликозилаза, присутствующая в ПЦР-смеси, отщепляет урацил от цепи ДНК, оставляя т.н. АР-сайт
Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О |
|
|
О- P |
О |
|
О– |
5`CH2 |
О |
|
4` |
1` |
|
|
|
|
3` |
2` |
О- Н
2)При нагревании до 950С UDG инактивируется, а AP-сайты расщепляются, в результате урацил-содержащая ДНК, попавшая в пробирку до начала ПЦР, деградирует
3)Проводится обычная ПЦР, реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
M ln 1 P R
М – среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе распределения Пуассона)
Р – доля сегментов, содержащих ПЦР-продукт
R – общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR:
•Количество сегментов реакции
•Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
•Реакционный объѐм
65
Коммерчески доступные системы, реализующие dPCR
|
Fluidigm - технология |
|
Bio-Rad (QuantaLife) - |
|
Life Technologies |
|
|
|
dPCR в суспензии |
|
dPCR в платах |
|
|
|
микрофлюидных чипов |
|
|
|
||
|
|
(Digital Droplet PCR) |
|
OpenArray® |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
66
Digital droplet PCR (ddPCR)
•QX100 Droplet Digital PCR System
Подготовка |
|
|
|
|
образцов |
Создание капель |
Амплификация |
Регистрация и |
|
(смешивание ДНК |
(Droplet Generator) |
анализ результатов |
||
|
||||
и ПЦР-реагентов) |
|
|
|
Сравнение с Real-Time PCR
Digital PCR: a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis? Bernhard G. Zimmermann, Simon Grill, Wolfgang Holzgreve. Prenat Diagn 2008; 28: 1087–1093.
68
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание