biotechnology-2012-03
.pdf
ПЦР
ПЦР
Праймеры
|
dNTP |
|
Буфер |
KCl |
|
Tris |
||
|
MgCl2
Полимераза
Матрица
Компоненты ПЦР
Определяют амплифицируемый участок Служат «затравкой» для синтеза ДНК
«Строительный материал»
Моновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
Бивалентный катион необходим для работы фермента
Осуществляет синтез ДНК
Анализируемый образец ДНК
Этапы ПЦР
|
Предварительная |
~950C |
1-10 мин |
|
|||
|
денатурация |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Денатурация |
~950C |
10-60 сек |
25-50 циклов |
Отжиг |
50-700C |
10-60 сек |
|
Элонгация |
68-720C |
10-180 сек |
|
Финальная |
68-720C |
7-10 мин |
|
элонгация |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
График диссоциации праймера
Cds – концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
Полимераза |
Процессивность |
Активности |
|||
|
|
|
|
|
|
|
Taq |
3-5 т.п.н. |
5'→3' полимеразная |
||
(Thermus aquaticus) |
5'→3' экзонуклеазная |
||||
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
Pfu |
|
|
5'→3' полимеразная |
|
|
1-2 т.п.н. |
5'→3' экзонуклеазная |
|||
(Pyrococcus furiosus) |
|||||
|
|
3'→5' экзонуклеазная |
|||
|
|
|
|
||
|
|
|
|
||
|
Tth |
3-5 т.п.н. |
5'→3' полимеразная |
||
|
(800 п.н. для |
5'→3' экзонуклеазная |
|||
(Thermus thermophilus) |
|||||
ревертазной активности) |
5'→3' ревертазная |
||||
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
Pwo |
3 т.п.н. |
5'→3' полимеразная |
||
(Pyrococcus woesei) |
3'→5' экзонуклеазная |
||||
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5`-3` полимеразная активность
Полимераза
3`-5` экзонуклеазная активность
5`-3` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатирование:
•твёрдый термоблок (элемент Пельтье)
•жидкость
•поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
• амплификация ДНК
Получение информации
• поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК