3.2.5. Защитные свойства внешних покровов пчел от микрофлоры.

Одним из основных элементов рационального применения бактерицидных препаратов в ветеринарии и в частности в пчеловодстве при инфекционных болезнях является определение чувствительности возбудителя болезни пчел к этим препаратам, что необходимо для того , чтобы избрать наиболее эффективный препарат из числа рекомендованных при заболевании и изучении новых бактерицидов , прогнозировать результативность терапии , а также для соевременной замены длительно применяемого в пчеловодстве препарата другим , если установлена резистентность к нему патегенных микроорганизмов - возбудителей бактериальных болезней пчел.

Разработка новых препаратов , несмотря на наличие разнообразных антибактериальных средств , остается весьма актуальной задачей , ввиду постоянно возрастающей устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний пчел к существующим лекарственным средствам.

Согласно данным литературы, в ходе эволюционного развития пчелы выработали свойство предупреждать многие заболевания , бороться с ними ,если они уже возникли.

Хитиновый покров пчел обладает бактерицидными и бактериостатичеекими свойствами , т.е. способностью подавлять рост и размножение вредных микроорга-низмов и даже убивать их (http:pchelovodstvo.boom.ru.).

Основываясь на этом факте,нами были предприняты исследования , целью которых являлся анализ воздействия хитинового покрова пчел на патогенную микрофлору,обнаруженную нами в улье и на тест-культуры микроорганизмов вызывающие различные другие заболевания пчел, любезно предоставленные нам Перским филиалом сельско-хозяйственной академии наук.

Чувствительность микроорганизмов в бактерицидам в лабораторных условиях , дает основание использовать их для лечения инфекционных болезней в условиях пасеки и наряду с этим дает возможность объяснить устойчивость пчелиных семей к тем или иным инфекциям.

Чувствительность микроорганизмов Вас. alvei, Вас. Larvae, Bac.paraalvei, Str.pluton, Str.liquifaciens, Ent.haf.var.alvei к препаратам хитина (хитозана, отличающимся от хитина молекулярной массой и растворимостью в воде), выделенного из ракообразных и подмора пчел ( технология выделения будет приведена далее в работе) определяли минимальной бактерицидной концентрацией (МБК), которая задерживает их рост. Для этой цели использовали два наиболее распространенных и рекомендованных метода : метод последовательных серийных разведений на жидкой среде и метод диффузии в агар с применением дисков ( "Методические указания по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных ", утв. ГУВ ,1971 ).

С целью изучения минимальной бактерицидной концентрации приготовили в стерильных пробирках жидкие питательные среды (МПБ) рабочих растворов хитозана методом последовательных серийных разведений.

Так как согласно данным литературы для хитозана ракообразных чувствительность культур , взятых для определения находится в пределах 0,01-0,1 мкг/мл , для получения необходимой концентрации хитозана в начале в пробирках готовили стерильный рабочий раствор с активностью 100 мкг/мл. В пробирки , содержащие по 9 мл. Питательной среды переносили из первой пробирки во вторую , из второй в третью и так до последней , по 1 мл среды с хитозаном. Таким образом , была получена питательная среда с концентрацией 10,0; 1,0 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 ; 0,0001 мкг/мл.

В качестве контроля использовалась питательные среды с внесенными соответствующими разведениями растворителя хитозана, отличающегося от физиологического раствора кислым рН.После этого наносили суспензию микробных клеток , учитывая примерное количество по стандарту мутности. Учет результатов бактерицидного действия препаратов хитозана вели ежедневно.

Для дальнейших исследований брали концентрации , которые задерживали рост возбудителей бактериальных болезней in vitro , по истечению 48-72 часов.

Результаты наших исследований показывают , что отсутствие роста наблюдается преимущественно в пробирках содержащих до ОД мкг/мл хитозана. Так , в пробирке с содержанием бактерицида 0,1 мкг/мл нет роста , а в следующей , где концентрация препарата 0,01 мкг/мл установлен рост культур.

Следовательно , значение минимальной подавляющей рост концентрации для микроорганизмов возбудителей болезней пчел Вас. alvei , Bac.paraalvei, Str.pluton, Str.liquifaciens, Ent.haf.var.alvei , округленный в сторону увеличения будет равен 0,1 мкг/мл. ( т.к. внесение в питательную среду половинной концентрации , т.е. 0,055 мкг/мл тоже дает положительный результат для таких культур как Bac.paraalvei, Str.plutop, Str.liquifaciens ). Для культур микроорганизмов , таких как Bac.larvae , Beh. coli минимальная бактерицидная концентрация для раствора хитозана определена как 1,0 мкг/мл.( табл.19).

Таблица 19.

Чувствительность возбудителей болезней пчел к хитозану в МПБ.

Вид	Концентрация препарата хитозан ,мкг/мл
Микро Организм ов	10,0	1,0	0,1	0,01	0,001	0,0001
Bac.alvei			_	+	+	4-
Вас. Larvae	-	-	+	4-	4-	4-
Вас. Paraalvei	-	-	-	+	4-	4-
Str. liquifa- ciens	-	-	-	4-	4-	4-

Str. Pluton	-	-	-	+	+	+
Ent.haf. var.alvei	-	-	-	+	+	+
Ech. Coli	-	-	+ .	+	+	+

Примечание: - отсутствие роста ; + наличие роста.

-для выращивания Вас.larvae Добавляли в питательную среду 10% стерильной лошадиной сыворотки.

1/ Для возбудителя американского гнильца - Bac.larvae и .coli , действительная минимальная бактерицидная концентрация соответствует 0,5 мкг/мл. Это указывает , что испытуемый микроорганизм более устойчив , к взятым концентрациям хитина.

При изучении бактерицидных свойств препарата хитина методом диффуции в агар , использовали метод последовательных серийных разведений в пробирках , готовили маточные растворы препаратов и вносили их в расплавленную питательную среду перед застыванием при температуре не выше 40-45°С , тщательно перемешивали вращательными движениями и разливали в чашки Петри. После этого наносили суспенцию микробных клеток ( стандарт мутности 9) на поверхность застывшего МПА в количестве 1 мл и распределяли ее равномерно по поверхности шпателем. Для выращивания Bac.larvae в расплавленный МПА ( температура 40-45°С) вносили 10% стерильную лошадиную сыворотку . Опыты проводили в трехкратной повторности. Для каждого разведения подбирали контроль.

Наблюдение за результатами опытов проводили в течение 10 дней при температуре 30°С учитывая при этом концентрацию препарата хитина , ингибирующую рост возбудителей гнильцовых болезней пчел на питательной среде. Полученные результаты соответствовали полученным результатам на жидких питательных средах с коэффициентом корреляции 0,95.

При использовании методов дисков в срельные чашки Петри , расположенные на горизонтальной поверхности разливали питательную среду обсемененную соответствующими патогенными микроорганизмами. Суспензию исследуемых микроорганизмов готовили по стандарту мутности в физиологическом растворе смывом с агаризованных косяков

.Микроорганизмы вносили в испытуемую питательную среду при температуре 40-45°С в количестве 1 мл при стандарте мутности 9.

На поверхность застывшего обсеменненого агара пинцетом раскладывали диски , пропитанные препаратом хитина на растоянии 2,5 см от центра чашки Петри.Последние оставляли при комнатной температуре на 3 часа для преддиффузии , а затем проводили инкубирование в термостате при температуре 30° С в течение 3 суток.

В связи с тем , что растворы хитозана готовят в растворители имеющим кислое значение рН,для иключения ингибирующего влияния на рост газона растворителя , ставили дополнительный контрольный опыт , где диски пропитывали чистым растворителем и при подведении результатов учитывали влияние последнего.

Результаты опытов учитывали путем измерения зон задержки роста бактерий вокруг дисков , включая диаметр самого диска. Данные представлены в таблице 20. Оценку эффективности хитина проводили в сравнении с антибиограммой байтрила , согласно которой для тест-дисков с 5 мкг байтрила на ИСО-сенситов-агаре (по Дин 58940) действительны следующие пределы чувствительности:

-чувствительность - при МБК < 0,5 мкг/мл - зона задержки роста > 22 мм. -среднечувствительный - при 1 мкг/мл - зона задержки роста 18-21 мм, - устойчивый - при МБК > 2 мкг/мл - зона задержки роста< 17 мм.

Как следует из приведенной выше таблицы , значение МБК для всех испытуемых штаммов микроорганизмов свидетельствует о высокой чувствительности их к хитозану. Из всех испытанных концентраций препарата хитозана , наиболее часто бактерицидная_/ активность проявлялась при концентрации 0,1 мкг/мл. ( для ВасЛагуае и БсЬ.соН - 0,5 мкг/мл ).

При этой концентрации зона задержки роста в 1,5-2,0 раза больше , чем при более низких концентрациях.

концентрации для Значения минимальных подавляющих микроорганизмов , возбудителей болезней пчел. Наименование тест-культуры	МБК, мкг/мл.	Зона задержки роста ,мм.
Вас.а1уе1	0,1	25± 3
Вас.1агуае	0,5	30+5

Таблица 20.

Вас.рагаа1уе1	од	28± 5
Бйг.НяшГааеш	од	23± 1
Зй.рМоп	од	24± 2
Еп11ш£уаг.а1уе1	од	22+5
5/ БСЬ.соН	0,5	22± 5

К исследованию были взяты , как говорилось ранее, образцы хитозана , полученного из ракообразных и из подмора пчел (два варианта),во всех вариантах опытов бактерицидная эффективность хитозана не зависимо от источника получения и была одинаковой , в таблицах приведены средний значения результатов по двум вариантов опытов.

На рис .18 представлены данные по бактерицидной и бактериостатической активности препаратов хитозана на патагенную микрофлору.

Таким образом,на данном этапе работы была показана бактерицидная способность хитозана, что в свою очередь объясняет устойчивость здоровой пчелиной семьи к наличию в ульях патогенной микрофлоры.

г г		Ш Бактерицидная активность хитозана ■ Бактериостатическая активность хитозана	Щ
\ 1			- 1
			в
\ щшш	I tj 01
B.alvei В.larvae	4. ^ § ft1 V s s s s » ^ h ."S			1
fa J i J JJ

Рис./* Бактерицидные и бактериостатические свойства хитозана

0,6

0,5

с; 2

0,4

аз

X

ш со О I—

s X

LÛ

0,3

0,2

0,1

0

VO К)

(пчелозана)