20.Неспецифическая серологическая диагностика сифилиса Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (рмп)

Является отборочным тестом при массовом обследовании населения на сифилис.

Постановка: плазма или инактивированная сыворотка крови + специ­альный кардиолипиновый антиген (экстракт бычьего сердца, обогащенный холестерином и лецитином). Образуется преципитат (комплекс антиген - ан­титело), выпадающий в осадок в виде хлопьев белого цвета.

РМП можно проводить и по количественной методике с разведением сыворотки крови.

Преимущества экспресс-метода:быстрота ответа (30-40 минут)небольшой объем необходимой для анализа крови (2-3 капли плазмы или сыворотки).

Источники ошибок при постановке РМП:

неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капил­ляре пипеток);неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недоста­точного перемешивания ее перед использованием;бактериальное загрязнение эмульсии;нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, ан­тигена и его эмульсии, растворов;использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипе­ток, пластинок, растворов.Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноот­рицательных, так и ложноположительных результатов реакции.После окончания терапии ставится РМП и по снижению титра судят о ди­намике инфекционного процесса и эффективности терапии.Подтверждением эффективности проведенной терапии считается сниже­ние титра в 4 и более раз в течение 1 года; по окончании этого срока осуще­ствляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании.

21.Серологическая диагностика сифилиса

Серодиагностика применяется для:подтверждения клинического диагноза сифилиса;постановки диагноза скрытого сифилиса;контроля за эффективностью лечения, как один из критериев изле- ченности больных сифилисом;профилактики сифилиса (обследование определенных групп населе­ния), позволяет выявлять иммунные сдвиги в организме больного в ответ на размножение в нем возбудителя болезни.

Антигенное строение бледной трепонемы:

Протеиновые антигены. Высоко иммуногенны, антитела против них появляются в организме в конце инкубационного периода или в течение пер­вой недели после появления твердого шанкра.Липидные антигены. Антитела против них появляются на 5-6 неделе после заражения.Антигены полисахаридной природы. Мало иммуногены. Антитела против них не достигают значимых титров, поэтому их роль в серодиагно­стике сифилиса незначительна.

Серологические реакции в зависимости от выявляемых антител под­разделяются на три группы:

Липидные (реагиновые реакции) реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП).групповые трепонемные реакции реакция иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА),

Видоспецифичные протеиновые трепонемные реакции реакция непрямой гемагглютинации бледных трепонем (РПГА)

Иммуноферментный анализ для серо- и ликвородиагностики сифилиса

Принцип:- аг Т. pallidum сенсибилизируются к поверхности твер¬дофазового носителя (лунки панелей). Добавляется исследуемая сыворотка. При наличии антител против Т. pallidum образуется комплекс антиген- антитело, связанный с поверхностью носителя. На следующем этапе в лунки наливают антивидовую сыворотку (против иммуноглобулинов человека), ме¬ченую ферментом (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Меченые анти-тела взаимодействуют с комплексом антиген-антитело, образуя новый ком¬плекс. Для его выявления в лунки наливают раствор субстрата (5- аминосалициовая кислота). Под действием фермента субстрат меняет цвет, что указывает на положительный результат.

Оптимальным в случае использования ИФА считается одновременное применение трех его вариантов:

- выявление суммарных AT (CAT)

- последующее дифференцированное определение трепонемоспецифических IgM и IgG.

Появление противосифилитических антител происходит в соответствии с общими закономерностями иммунного ответа. Вначале появляются IgM на 2- 4 неделе после заражения и исчезают у нелеченных больных примерно через 18 месяцев; при лечении раннего сифилиса через 3-6 месяцев; позднего - че¬рез год. По мере развития болезни начинает преобладать синтез IgG, которые появляются на 4 неделе после заражения, достигают более высоких титров и длительно сохраняются даже после клинического излечения.

Источники возникновения ошибок при использовании ИФА-тест- систем:

- нарушения техники взятия крови, условий транспортировки и хранения тест-систем и проб.

- некачественная работа лаборантов,

- любые отклонения от инструкции по применению тест-системы,

- неисправность инструментов и приборов,

Реакция иммунофлюоресценции для специфической серо- и ликвородиагностики сифилиса

Принцип: специфический комплекс антиген-антитело + иммунная анти- видовая сыворотка, меченная флюорохромом, и выявление с помощью лю¬минесцентного микроскопа.

В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Здоровых кроликов - сам¬цов заражают интратестикулярно и при возникновении орхита извлекают из яичек Т. pallidum.

С одним и тем же антигеном реакция может ставиться в течение 2-4 меся¬цев.

В настоящее время применяется РИФ-абс, РИФ-200 (испытуемые сыво¬ротки крови разводят в 200 раз фосфатным буфером).

В связи с возможностью получения отрицательных результатов при нали¬чии флюоресцирующих антител не следует исследовать кровь и сыворотку крови в РИФ-абс и РИФ-200 во время лечения больных пенициллином.

Ложноположительные результаты отмечали у беременных, алкоголиков, больных ревматоидным артритом, системной и дискоидной красной волчан¬кой, склеродермией, циррозом печени.

РПГА. Принцип: сыворотка крови, содержащая специфические антитела + эритроциты, сенсибилизированные соответствующим антигеном = харак¬терная агглютинация.

Общее мнение исследователей заключается в том, что РПГА является ценным диагностическим тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания. Реакция становится по¬ложительной на 3 неделе после заражения и остается таковой спустя много лет после выздоровления.

Результаты РПГА учитывают через 1,5-2 ч при микрометоде или на следующий день при макрометоде. Неподвижно стоящие пластины даже при высыхании их содержимого сохраняют полученную картину:

"4+" - положительная РПГА. Эритроциты равномерно выстилают всю по¬верхность лунки (в виде зонтика).

"3+" - положительная РПГА. Эритроциты выстилают всю поверхность лунки, но часть их соскальзывает к центру.

"2+" - слабоположительная РПГА. Эритроциты образуют пленку на не¬большом участке нижней части лунки.

"1+" - отрицательный результат РПГА. На дне лунки эритроциты образуют рыхлый осадок.

- отрицательная РПГА. Эритроциты ровным плотным "колечком" или "пуговкой" лежат на самом дне лунки (без окружающего зернистого осаждения).

Ложноположительные результаты могут быть получены при исследо¬вании сывороток крови пациентов с невенерическими трепонематозами, за счет ревматоидного фактора и перекрестно реагирующих с трепонемным антигеном антител, образующихся при различных системных или индуци¬рованных лекарствами и наркотиками нарушениях обмена, из-за аномально¬го уровня иммуноглобулинов;у новорожденных детей - за счет образова¬ния в организме плода или ребенка IgM-антител к IgG матери, что осложня¬ет трактовку результатов и диагностику врожденного сифилиса.

Ложноотрицательные результаты реакции могут быть обусловлены конкуренцией между IgM- и IgG-антителами.