2.2.3 Культивирование протокормов и регистрация изменений их ростовых параметров при обработке фитогормонами
Культура протокормов была получена из семян (см. подразделы 2.3 и 2.4). Для проведения данного эксперимента использовалась среда Fast [20], модифицированная мезоинозитом (10 мг/л), FeNa2-EDTA (5 мл/л), гуматом калия (10 мг/л), пептоном (2 г/л), дрожжевым экстрактом (2 г/л), фруктозой (8 г/л), сахарозой (12 г/л), активированным углём (2 г/л).
Среду дополняли брассиностероидами: БЛ, ЭБ, ГБ, КС, ЭК и ГК в концентрациях от 10-10 до 10-6 М и ауксинами: ИУК, ИМК, НУК и 2,4-Д в концентрациях 0,3; 1 и 5 мг/л для каждого ауксина соответственно. Рост стерильных протокормов микроклонов Phalaenopsis × hybridum Blume на средах, дополненных различными концентрациями БС и ауксинов был проанализирован по длине и массе микрорастений.
2.3 Статистический анализ данных
Для обработки полученных результатов использовались стандартные методы вариационной статистики. Основными статистическими характеристиками служили: средняя арифметическая величина (Х) – формула (2.1), среднее квадратичное отклонение () – формула (2.2) и ошибка средней величины (Sx) – формула (2.3).
|
(2.1) |
где Xj – сумма всех повторностей измерения,
n – число повторностей.
|
(2.2) |
где (Xj – X) – сумма квадратов отклонений от среднеарифметической величины.
|
(2.3) |
Выявление достоверных различий между полученными данными (длина и масса ППТ) выполнено при помощи программного пакета GraphPad Prism v.7.0 по t-критерию Стьюдента. Данный критерий сравнивает средние значения двух выборок и вычисляет вероятность того, что данные выборки относятся к одной и тойже генеральной совокупности [2].
Глава 3 результаты и их обсуждение
Было протестировано влияние шести брассиностероидов (БЛ, ЭБ, ГБ, КС, ЭК и ГК, и четырех ауксинов (ИУК, ИМК, НУК и 2,4-Д) на рост ППТ Phalaenopsis × hybridum Blume, полученных из семян, в условиях in vitro. Были получены и проанализированы данные, демонстрирующие характер изменений длины и массы растений Phalaenopsis при введении в среду вышеуказанных гормонов (рисунки 3.1-3.10).
3.1 Изменение показателей скорости роста и биомассы растений Phalaenopsis при добавлении в среду различных брассиностероидов
Введение в среду БС вызывало усиление ростовых процессов, что выражалось в увеличении длины протокормов и приросте их массы. Наибольшим стимулирующим эффектом на длину растений обладал БЛ (рисунок 3.1). Он вызывал достоверный прирост длины (на 28%) по сравнению с контролем уже в концентрации 10-10 М.
А К – контроль, концентрации БС указаны в М (моль/л)
|
|
|
|
А – внешний вид микрорастений, сформировавшихся из ППТ через 100 сут после обработки БС; Б, В – масса и длина растения (X±Sx; n = 16); К – контрольные условия
Рисунок 3.1 – Эффект 10-10–10-6 М БЛ на рост микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume
Было обнаружено постепенное усиление эффекта при использовании более высоких уровней данного фитогормона. При концентрации БЛ 10-7 М наблюдалось двукратное увеличение длины микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume по сравнению с контрольными образцами. В концентрации 10-6 М наблюдалось снижение эффекта, однако данные различия не являлись достоверными, в результате чего нельзя говорить о насыщении гормона при уровне 10-7 М.
Схожие результаты БЛ показал и в увеличении массы растений. Уже в концентрации 10-10 М наблюдался достоверный прирост биомассы на 30% по сравнению с контрольными данными. Максимальный эффект достигался при концентрации 10-6 М – увеличение массы почти в 2,5 раза.
Наибольшим стимулирующим эффектом по приросту массы среди БС обладал ЭБ (рисунок 3.2). Не смотря на отсутствие достоверных результатов при минимальной исследуемой концентрации, уже при уровне данного фитогормона 10-9 М была выявлена стимуляция на 63%. Максимальный эффект вызывала концентрация 10-7 М, наблюдалось увеличение массы в 2,7 раза. С увеличением концентрации эффект достоверно снижался, что может говорить о насыщении при более низком уровне ЭБ.
А К – контроль, концентрации БС указаны в М (моль/л)
|
|
|
|
А – внешний вид микрорастений, сформировавшихся из ППТ через 100 сут после обработки БС; Б, В – масса и длина растения (X±Sx; n = 16); К – контрольные условия
Рисунок 3.2 – Эффект 10-10–10-6 М ЭБ на рост микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume
ЭБ также оказался весьма эффективным при увеличении длины микрорастений и показал схожие с БЛ результаты. Однако данный эффект проявлялся лишь при добавлении более высоких уровнях гормона, при низких концентрациях достоверность установлена не была. Биомасса растений в концентрации 10-7 М почти достигла двукратного прироста.
ЭК оказывал схожую с ЭБ и БЛ стимуляцию по приросту массы, однако ЭК проявлял высокую эффективность только при добавлении в среду высоких концентраций – 10-7 и 10-6 М. При низких уровнях данного фитогормона достоверных данных по стимуляции массы не было обнаружено (рисунок 3.3). Значительный прирост массы на 67% наблюдался лишь при концентрации 10-8 М и достигал увеличение в 2,5 раза при 10-6 М.
А К – контроль, концентрации БС указаны в М (моль/л)
|
|
|
|
А – внешний вид микрорастений, сформировавшихся из ППТ через 100 сут после обработки БС; Б, В – масса и длина растения (X±Sx; n = 16); К – контрольные условия
Рисунок 3.3 – Эффект 10-10–10-6 М ЭК на рост микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume
Прирост длины при обработке ЭК был выявлен и при низких концентрациях, но был незначительным, лишь на 16% по сравнению с контрольными растениями. При увеличении концентрации гормона до 10-7 М эффект увеличивался до 72%. Для ЭК также была обнаружена закономерность снижения стимуляции ростовых процессов при увеличении концентрации до 10-6 М по сравнению с эффектами при 10-7 М, что, как и в случае с ЭБ, может указывать на насыщение по данному гормону при концентрации 10-7 М.
КС продемонстрировал закономерное увеличение показателей с повышением действующих концентраций (рисунок 3.4). При добавлении в среду КС в концентрации 10-10 М наблюдался достоверный прирост массы и длины микрорастений на 25%. Максимум достигался при концентрации 10-6 М, при этом увеличение длины по сравнению с контрольными результатами составляло 76%, а прирост массы достигал двукратного увеличения .
А К – контроль, концентрации БС указаны в М (моль/л)
|
|
|
|
А – внешний вид микрорастений, сформировавшихся из ППТ через 100 сут после обработки БС; Б, В – масса и длина растения (X±Sx; n = 16); К – контрольные условия
Рисунок 3.4 – Эффект 10-10–10-6 М КС на рост микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume
ГК также проявлял максимальный эффект при максимальной исследуемой концентрации – 10-6 М и достигал эффектов аналогичных КС (рисунок 3.5). Было достигнуто двукратное увеличение массы и прирост длины растений приблизительно на 75%. Концентрация ГК 10-10 М не показала статистически достоверных данных по увеличению длины растений.
Отсутствие достоверных результатов при низких концентрациях было обнаружено и при добавлении другого синтетического аналога КС – ЭК, что может говорить о более слабом эффекте данных гормонов по сравнению с их природным аналогом.
А К – контроль, концентрации БС указаны в М (моль/л)
|
|
|
|
А – внешний вид микрорастений, сформировавшихся из ППТ через 100 сут после обработки БС; Б, В – масса и длина растения (X±Sx; n = 16); К – контрольные условия
Рисунок 3.5 – Эффект 10-10–10-6 М ГК на рост микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume
ГБ показал достоверное увеличение массы и длины растений во всём спектре исследуемых концентраций. Начиная с 10-10 М ГБ проявлял увеличение массы на 36% и длины на 42%. Однако повышение концентраций ГБ до 10-7-10-6 М не дало ожидаемого увеличения показателей массы и длины, наблюдаемое при использовании других БС. Таким образом ГБ вызывал наименьшую стимуляцию роста по сравнению с другими исследуемыми БС (рисунок 3.6).
Полученные в данной работе результаты указывают на стимулирующее влияние БС на рост культуры протокормов Phalaenopsis × hybridum Blume. Ранее влияние БС на рост данного растения в культуре in vitro изучено не было. Однако было показано, что БС способны стимулировать рост культур Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Eucalyptus camaldulensis, Catharanthus roseus [16, 24].
А К – контроль, концентрации БС указаны в М (моль/л)
|
|
|
|
А – внешний вид микрорастений, сформировавшихся из ППТ через 100 сут после обработки БС; Б, В – масса и длина растения (X±Sx; n = 16); К – контрольные условия
Рисунок 3.6 – Эффект 10-10–10-6 М ГБ на рост микрорастений Phalaenopsis × hybridum Blume