1.1 Размножение орхидей

Для семейства Orchidaceae Juss. характерно наличие двух разных типов естественного размножения: бесполое (вегетативное) и половое (генеративное). При вегетативном размножении новое растение получается в результате отделения части материнского организма, при генеративном растение вырастает из семян. В данном разделе обобщены классические и современные данные о размножении орхидей с акцентом на выявление оптимальных условий размножения и культивирование данных растений in vitro.

1.1.1 Размножение орхидей в природе

Вегетативное размножение орхидей. Вегетативное размножение непосредственно связано с интенсивностью ветвления: увеличение числа особей осуществляется благодаря увеличению числа боковых побегов на растении, которые постепенно теряют с ним физическую связь. Для большинства наземных орхидей интенсивность ветвления корневищ обусловлена физиологическим состоянием растения. Интенсивность ветвления коррелирует с силой и возрастом растения [5]. Помимо размножения с помощью корневища, некоторые виды орхидей могут делиться, образуя "детки" или боковые побеги [7], которые, достигнув определённого размера, отделяются от материнского растения и укореняются.

Размножение орхидей семенами. Семена орхидей лишены запасных питательных веществ, которые обеспечивают проростку всё необходимое для роста [7]. В природе семя орхидеи прорастает только в присутствии гриба-симбионта, который снабжает его необходимыми питательными веществами, до тех пор, пока растения не начинают фотосинтезировать. Процесс созревания плода занимает достаточно длительный период (6-12 месяцев) [3]. После вскрытия семена практически сразу попадают в условия, подходящие для прорастания, однако в природных условиях прорастает менее 5% семян [1]. В одном плоде может содержаться от нескольких тысяч до нескольких миллионов семян, в связи с чем, у тропических орхидей нет необходимости формировать семенные запасы и обеспечивать их длительную жизнеспособность.

1.1.2 Методы культивирования и размножения орхидей in vitro

В начале XX века Бернардом, Бургеффом и Кнудсоном были заложены основы размножения тропических орхидей в условиях in vitro [11-13, 30]. Начало работ в данном направлении в СССР было положено в 1951-1957 гг. в лаборатории Главного ботанического сада АН СССР В.А. Поддубной-Арнольди и В.А. Селезневой, которые получили гибриды от межсортовых и межвидовых скрещиваний растений из таких родов, как Dendrobium, Cypripedium, Cattleya [8, 38].

Необходимым условием культивирования растений in vitro является соблюдение строгой асептики. Для соблюдения стерильных условий при выполнении работ стерилизации должны подвергаться помещение, в котором производят посадку культур, одежда и руки работающего персонала, посуда и инструменты, необходимые для культивирования объектов, питательные среды и непосредственно объекты культивирования [8, 18]. При проведении асептических работ используют ламинарный бокс, в котором постоянно происходит циркуляция стерильного воздуха [18]. Ламинарные боксы оснащены УФ лампами, которые обеспечивают стерилизацию внутренней поверхности бокса.

Для культивирования проростков используют помещение, оборудованное стеллажами с люминесцентными лампами. Световой режим для многих орхидей при культивировании in vitro схож (длина светового дня составляет 16 часов). Необходимо поддерживать постоянную температуру 20-26 ^оС и относительную влажность воздуха 60-80% [3].

Растительные ткани сами по себе могут служить источником заражения, так как на их поверхности всегда находятся эпифитные микроорганизмы. Для их стерилизации используется большой набор химических веществ. Следует подбирать определённую концентрацию стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали бы максимальную стерильность и легко удалялись из ткани промыванием стерильной дистиллированной водой или подвергались деградации [7, 24]. Наиболее часто используются растворы соединений ртути, гипохлориты натрия и кальция, перекись водорода, фенол, этанол, перманганат калия.

Одной из основных составляющих успешного культивирования является подбор высокопроизводительной питательной среды. Для выращивания орхидей используются жидкие или твердые агаризованные питательные среды. Состав и консистенция среды зависят от вида растения и целей исследователя. Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: МС, Уайта, Гамборга, Линсмайера-Скуга и др. [18, 24]. В состав таких питательных сред входят различные комбинации веществ: источники углеводов (сахароза, фруктоза), витамины, макро- и микроэлементы, гелирующие агенты, фитогормоны [4, 8, 38]. В питательную среду также часто добавляется активированный уголь. Влияние угля вероятно связано со связыванием фенолов, алкалоидов, терпенов, дубильных веществ и др., которые выделяются растением при ранении и могут вызывать угнетение роста. Для культур in vitro оптимальное значение рН составляет 5,5-5,8. Для посева семян орхидных и дальнейшего роста проростков чаще всего используются среды Fast [20], МС [35] и среда Кнудсона [30]. Готовую питательную среду разливают по колбам и стерилизуют. При культивировании растений in vitro необходимы регулярные пересадки на новую питательную среду, вследствии истощения сред и накопления в ней большого количества вторичных метаболитов, которые ингибируют рост и развитие культуры.