2 Этап.

Препарат «раздавленная» капля

Препарат «висячая» капля

Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество мате-риала для исследования. Затем на каплю накла-дывают покровное стекло таким образом, чтобы между ним и предметным стеклом не было пузырьков воздуха. Если культура выращена на жидкой питатель-ной среде, то для приготовления препарата используют пастеровскую пипетку, с помощью которой каплю культуры наносят на предметное стекло.

Препарат готовят аналогичным образом, но каплю культуры наносят на покровное стекло, которое затем накладывают на предметное стекло с лункой, края которой смазаны вазели-ном. Стекла склеиваются и получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

50. Риккетсии. Биологические особенности. Методы окраски.

Риккетсии представляют собой полиморфные микроорганизмы, живут и размножаются только в клетках (цитоплазме и ядре) тканей животных, человека и переносчиков. Кокковидные формы имеют вид очень мелких, гомогенных или однозернистых овоидов диаметром около 0,5 мкм; довольно часто они образуют диплоформы. Палочковидные формы риккетсий — короткие образования размером 1 —1,5 мкм с зернами на концах или длинные и обычно изогнутые тонкие палочки длиной 3—4 мкм. Нитевидные (мицеллярные) формы имеют размер 10—40 мкм и более; иногда это изогнутые и многозер­нистые нити.

Риккетсии не образуют спор и капсул; они неподвижны, хорошо окрашиваются по Романовскому — Гимзе, Цилю — Нильсену, грамотрицательны. 

Патогенные риккетсий из семейства Rickettsiaceae поражают различные виды животных и человека; заболевания, вызыва­емые риккетсиями, носят название риккетсиозов.

Окрашивание препаратов риккетсий по Здродовскому. Готовят фиксированный препарат риккетсий, окрашивают в течение 5 минут разведенным фуксином Циля (10–15 капель на 10 мл дистиллированной воды), промывают водой. Затем мазок обрабатывают 0,5 % раствором лимонной кислоты или 0,01 % раствором хлористоводородной кислоты, промывают водой. Далее препарат окрашивают метиленовым синим в течение 1 минуты, промывают водой и высушивают. Риккетсии окрашиваются в красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют – в голубой, а ядра – в синий.

51.Дыхание бактерий. Типы, источники энергии. Способы культивирования строгих анаэробов.

Дыхание, или биологическое окисление, основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) во­дорода или электронов;восстановление — присоединение водо­рода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным).

Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии сво­бодного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода яв­ляются органические соединения, то такой процесс называетсяброжением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязатель­ные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Методы культивирования анаэробов.

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта — Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздухаиндифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄.

Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

52.Выделение чистой культуры бактерий. Определение. Цель.

Чистая культура микроорганизма- это популяция клеток одного вида, вы­росшая на стерильной питательной среде. Чистую культуру выделяют путем полу­чения потомства одной родительской клетки. Культура может расти в виде отдель­ных колоний на плотной питательной среде.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.

Все методы выделения чистых культур из микробных смесей можно разделить на 2 группы:

1. Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

2. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому

Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На первую чашку петлей или пи­петкой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей по­верхности агара. Затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в третью чашку Петри и аналогичным образом производят посев. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний (сплошной pocт) на третьей - мини­мальное в виде отдельно расположенных колоний.

Метод истощающего штриха

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив её на 4 сектора и последовательно засеяв штрихом. Для этого материал берут пет­лёй и проводят ею на расстоянии 5 мм друг от друга ряд параллельных штрихов сна­чала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на пет­ле клетками засевают все другие секторы. При каждом последующем штрихе про­исходит уменьшение количества засеваемых клеток. После рассева чашки перевора­чивают вверх дном, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри, не мешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате 1-7 суток, так как скорость роста различных микроорга­низмов неодинакова.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль после­дующих штрихов вырастают обособленные колонии, представляющие собой потом­ство одной клетки.

Метод прогревания

Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогре­вают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 минут. При этом поги­бают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают, образуя колонии только спорообразующих бакте­рий.

Метод обогащения

Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способст­вующие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод заражения лабораторных животных

Этот метод используется для выделения чистой культуры из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, или в том случае, когда в исследуемом материале очень мало патогенных микроорганизмов.

Для за­ражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю ин­фекции виды животных. Например, для выделения пневмококка из мокроты зара­жают белую мышь. Это животное весьма чувствительно к данному микробу и резистентно к другим микробам, находящихся в мокроте. В связи с этим пневмококк быстро размножается в организме мыши, а другие микробы погибают. Через 18-20 часов после заражения мышь забивают и кровь, взятую из сердца, засевают на питательную среду. Так как в крови содержится один пневмококк, то на питатель­ной среде вырастает чистая культура.

Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других, находящихся с ним в смеси.

Метод Шукевича

Применяется для выделения подвижных микроорганизмов. Исследуемый ма­териал засевают в конденсационную воду скошенного агара, находящегося в про­бирке. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы "вползают" на его поверхность. Из верхней час­ти роста производят высев в конденсационную воду свежей питательной среды. Производя таким образом несколько пересевов, в конце концов получают чистую культуру подвижной бактерии.

Метод ингибирования

Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиоти­ков на микроорганизмы. Определённые вещества угнетают рост одних микроорга­низмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задержвают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные.

Первый этап выделения чистой культуры

1. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.

2. Производят посев на чашки Петри с питательным агаром. Для этого исследуемый материал, в случае необходимости, разводят стерильным физиологическим раствором. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательной среды в чашке Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещяют в термостат при 37ºС на 18-24 ч.

3. Производят посев на элективную питательную среду.

4. Производят посев на дифференциально-диагностическую среду.

5. Заражают лабораторных животных исследуемым материалом.

53.Рост и размножение бактерий, понятия, фазы роста.

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием — самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде.Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:

1.лаг-фаза;

2.фаза логарифмического роста;

3.фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

бактерий;

4.фаза гибели бактерий.

Лаг-фаза — период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде.Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

54.Среда Плоскерева, ее характеристика.

Среда Плоскирева (именуемая еще бактоагаром Ж) является питательной средой для выращивания некоторых микроорганизмов, в основном шигелл и сальмонелл. Как источник для нее используют инфицированные материалы: мочу, желчь, испражнения.

Среда Плоскирева - материал для культивирования кишечных бактерий, а значит, должна содержать несколько видов питательных веществ. Выпускается она в сухом виде. Довольно большую долю в ее общей массе имеет панкреатический гидролизат кильки (10,4 г/л). Чуть меньше приходится на двузамещенный гидроцитрат натрия (8,5 г/л). Также здесь содержится сухой питательный бульон и молочный сахар (8,62 и 7,3 г/л). Второе название среды Плоскирева - бактоагар Ж. В составе его присутствует агар в количестве 6,94 г/л. Содержание безводного сериоватистокислого натрия равно 5,1 г/л. Имеется наличие обезвоженного фосфата динатрия - 2,1 г/л, натриевых солей желчных кислот около 3,46 г/л, а кальцинированной соды - 2,4 г.

55.Влияние физических и химических факторов на бактерии. Стерилизация, способы, контроль их качества

Микроорганизмы находятся в тесной зависимости от условий окружающей среды. Выделяют физические, химические и биологические факторы внешней среды, влияющие на микроорганизмы. Физические факторы. Из физических факторов наибольшее влияние на микроорганизмы оказывают температура, влажность, излучение. Температура. По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на мезофильные, психрофильные и термофильные. Для мезофилов оптимальные температуры роста лежат между 20 и 40°С. Область температур роста психрофилов лежит в пределах от 0 до 20°С. Термофильные бактерии растут при температурах от 40 до 98°С. Для сохранения жизнеспособности бактерий благоприятны низкие температуры (ниже 0°С). Споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте (температура минус 196°С). Влажность. Важнейшим фактором поддержания жизнеспособности микробной клетки является вода, поскольку именно в растворах протекают все биологические процессы. Вода находится в клетке в свободном или связанном состоянии. Действие излучения. Солнечный свет может обеспечивать выраженный антимикробный эффект. Ультрафиолетовое излучение вызывает замедление роста культур, снижает скорость деления клеток, способствует развитию мутаций. УФ-лучи широко применяются для обеззараживания воздуха в помещениях, воды, отходов производства .Ионизирующее излучение вызывает повреждения ДНК, которые принято подразделять на прямые и опосредованные, возникающие в связи с образованием свободных радикалов. Ионизирующее излучение используется для стерилизации биопрепаратов, перевязочного материала, инструментов. Действие лазера вызывает у микроорганизмов в зависимости от дозы облучения изменения морфологических и биохимических свойств, вплоть до утраты жизнеспособности. При этом происходит денатурация белка и повреждение нуклеиновых кислот. Влияние химических факторов на микроорганизмы. Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на микроорганизм непосредственно или косвенно. От значения рН зависит состояние веществ в окружающей среде. Многие органические кислоты в кислой среде находятся в недиссоциированной форме и легко проникают в клетку, становясь токсичными для нее. Границы значений рН, оптимальных для роста различных микроорганизмов, находятся в пределах от 1,0 до 11,0. В зависимости от отношения к кислотности среды прокариоты могут быть разделены на несколько групп. Для подавляющего большинства прокариотов оптимальной является среда, близкая к нейтральной. Такие организмы называют нейтрофилами. Многие нейтрофилы способны расти или выживать при значениях рН, лежащих за пределами указанного диапазона. Такие прокариоты считаются кислото- или щелочеустойчивыми. К кислотоустойчивым относятся многие грибы, микобактерии (туберкулезная палочка). Устойчивыми к значениям рН близким к 9,0-10,0, являются многие из кишечных бактерий. У некоторых видов бактерий оптимум рН для роста находится в кислой (рН 4,0 и ниже) или щелочной (рН от 9,0 и выше) области. Такие бактерии называются ацидофильными и алкалофильными (кислотолюбивыми или щелочелюбивыми), соответственно. Соединения и ионы, токсичные для бактерий. Действие токсичных для бактерий соединений может быть бактериостатическим или бактерицидным. Бактериостаз – это задержка роста и размножения бактерий, вызванная действием неблагоприятных химических или физических факторов. Прекращение действия фактора приводит к возобновлению роста и деления. Бактерицидные факторы вызывают гибель клеток. Во многих случаях вещество в небольших концентрациях обладает бактериостатическим, а в высоких - бактерицидным действием. Стерилизация - это процесс уничтожения всех видов микробной флоры, в том числе их споровых форм, и вирусов с помощью физических или химических воздействий. Принято считать медицинское изделие стерильным, если вероятность его бионагрузки равна или менее 10 в степени -6. Стерилизации должны подвергаться медицинские изделия, контактирующие с кровью пациента, контактирующие с раневой поверхностью и соприкасающиеся со слизистой оболочкой и могущие вызвать нарушение ее целостности. Стерилизация -сложный процесс, для успешной реализации которого необходимы следующие требования: - эффективная очистка; - соответствующие упаковочные материалы; - соблюдение правил упаковки медицинских изделий; - соблюдение правил по загрузке стерилизатора упаковками с медицинскими изделиями; - адекватное качество и количество стерилизуемого материала; соответствующая работа оборудования; - соблюдение правил хранения, обращения и транспортировки простерилизованного материала.

56.Материальная основа наследственности микробов. Генотип, фенотип

Генотип - это общая сумма генов микроба. В отношении микро­организмов "генотип" означает то же, что "геном".

Фенотип - это весь комплекс свойств микроба, проявление генотипа в определенных, конкретных условиях существования.

Генотип - это возможные способности клетки, а фенотип - видимое их проявление. Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства микроорганизмов, является ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного белка, называется геном. В генах закодирована генетическая информация о всех свойствах клетки: форме, структуре белков и их функциях. Полный набор генов, которыми обладает клетка, представляет ее генотип. Генотип определяет потенциальную возможность проявления свойств клетки микроорганизма.

Бактериальная клетка имеет множество генов, каждый из которых несет информацию и контролирует синтез одного белка или соответствующего соединения. Гены подразделяются на структурные гены, гены-регуляторы и гены-операторы. В структурных генах закодирована информация о первичном строении контролируемого ими белка, т.е. о последовательности расположения аминокислот, входящих в состав белка. Гены-регуляторы контролируют синтез белков-репрессоров, подавляющих функцию структурных генов, а гены-операторы выполняют роль посредников между генами регуляторами и структурными генами.

Гены обозначают строчными начальными буквами названия синтезируемого под их контролем соединения (например, his – гистидиновый ген, arg – аргининовый ген, lac и mal – гены, контролирующие расщепление coответственно лактозы мальтозы).

Свойства микроорганизмов, проявляемые в тех или иных условиях их су­ществования, называют фенотипом. Другими словами, фенотип представляет собой сумму признаков, определяемых генотипом, реализованных в конкретных условиях внешней среды. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут образовывать особи с разными фенотипами. Фенотип бактерий обозначается теми же символами, что и генотип, но первая буква прописная (His , Arg , Lac и др.)

Фенотипические изменения

При фенотипической изменчивости микробы, образовавшиеся из одной материнской клетки, могут различаться между собой по ферментативной активности, морфологическим признакам, потребности в источниках питания.

К фенотипической изменчивости относятся:

Адаптация – приспособление микроорганизмов к новым условиям среды. В настоящее время это явление объясняется не изменением в микробной клетке, а развитием ранее измененных особей и гибелью неприспособленных. Таким образом, происходит естественный отбор.

Диссоциация – культурная изменчивость, когда, например, из засеянной на плотную среду чистой культуры вырастают резко отличающиеся по морфологической структуре колонии (тип S – гладкие, тип R – шероховатые, тип M – слизистые).

Модификация – изменение микроорганизмов под влиянием условий среды. Изменяются только фенотипические (внешние) признаки (форма, размеры, цвет колоний). Модификация наблюдается в нормальных условиях жизни, это реакция на внешние раздражения, не связанные с нарушением физиологических процессов в организме. Модификационные изменения легко исчезают при устранении условий, их вызвавших.

Генотипические изменения. Изменчивость признаков микроорганизмов, обусловленная перестройкой генетического аппарата, проявляется в виде мутаций и генетических рекомбинации (комбинативные изменения).

Мутации – внезапные, скачкообразные изменения генов. Процесс мутирования генов приводит к таким изменениям, которые передаются по наследству и сохраняются даже тогда, когда вызвавший их фактор перестает действовать.

Спонтанные мутации (без направленного воздействия) очень редки: примерно одна на 100 тыс. Онихарактеризуются изменениемкакого-нибудьодногопризнака и обычно стабильны.

Индуцированные или мутагенные мутации возникают вследствие воздействия факторов среды. Они встречаются сравнительно часто. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовые, рентгеновские и радиоактивные излучения, которые вызывают повреждение генетического аппарата клетки. К химическим мутагенам относятся сильнодействующие вещества: отравляющие (иприт), лекарственные (йод, перекись водорода), кислоты и др. Примером биологических мутагенов может быть ДНК.

Бактериальные клетки, в которых произошла мутация, называют мутантами.

Генетические рекомбинации заключаются в объединении и обычно немедленной перетасовке генов, принадлежащих близкородственным, но генотипически различным организмам.

Генетические рекомбинации у эукариот – это образование индивидумов с новым сочетанием продуктов в результате полового процесса.

У прокариот комбинативные изменения проявляются в результате трансформации, трансдукции, конъюгации.

Трансформация – перенос генетической информации от бактерии донора (в форме отдельных фрагментов ее ДНК) в клетку реципиента. Наиболее эффективно трансформация происходит у бактерий одного и того же вида или близкородственных видов. При этом в хромосому реципиента включается только одна нить ДНК донора с образованием молекулярной гетерозиготы.

Обычно бактериальная клетка в результате трансформации приобретает одно свойство. С помощью трансформирующей ДНК передаются такие признаки, как капсулообразование, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и т.д.

Трансдукция – перенос генов (фрагментов ДНК) от донорской клетки бактерии к реципиентной посредством умеренного фага.

При трансдукции возможен перенос генов, контролирующих особенности питания бактерий, двигательный аппарат (жгутики) и другие свойства.

Конъюгация – форма полового процесса, при котором происходят соединение мужской и женской микробных клеток и обмен между ними ядерным веществом через цитоплазматический мостик, образующийся между клетками. При этом генетический материал клетки-донора переходит в клетку-реципиент. После рекомбинации и деления клетки образуются формы с признаками конъюгирующих клеток.

Таким образом, все три формы комбинативной изменчивости одинаковы по существу. При трансформации участок ДНК клетки-донора входит в клетку-реципиент; при трансдукции эту роль выполняет фаг, а при конъюгации перенос генетической информации осуществляется через цитоплазмитический мостик (пили).

Вследствие генетических рекомбинаций образуются новые бактериальные клетки – рекомбинанты, у которых имеются наследственные признаки обоих «родителей».

57. Методика окраски спор

Метод Ауески. Высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5% -ной соляной кислотой с подогреванием (2-3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламенем. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров (7-8 мин), краску сливают, препарат обрабатывают 5% -ным раствором серной кислоты (5-7 с), хорошо промывают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4-5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют под иммерсией: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Меллера. Фиксированный на пламени препарат протравливают 5% -ной хромовой кислотой (2-3 мин), промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. Далее поступают, как в предыдущем методе. Результат окраски тот же: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих двух методах, только без протравы. После окрашивания вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синью с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота (10 с), смывают, просушивают. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в красный.

58. Плазмиды бактерий, их свойства. Транспозоны, вставки-последовательности, их характеристика.

Плазмиды — фрагменты ДНК, несущие от 40 до 50 генов. Выделяют автономные и интегрированные плазмиды.

• Автономные плазмиды существуют в цитоплазме бактерий и способны самостоятельно репродуцироваться; в клетке может присутствовать несколько их копий.

• Интегрированные плазмиды репродуцируются одновременно с бактериальной хромосомой. Интеграция плазмид происходит при наличии гомологичных последовательностей ДНК.

Плазмиды выполняют регуляторные или кодирующие функции. Регуляторные плазмиды участвуют в компенсировании тех или иных дефектов метаболизма бактериальной клетки. Кодирующие плазмиды привносят в бактериальную клетку новую генетическую информацию.

Выделяют следующие группы плазмид:

F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров с бактериями-реципиентами.

R-плазмиды кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (например, к), а также к тяжёлым металлам.

Транспозоны

Представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие 2000-20500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. Транспозоны реплицируются только в составе бактериальной хромосомы. Οʜᴎ могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, ферментов, разрушающим антибиотики.

IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (insertion – вставка, sequence – последовательность) (вставки последовательностей оснований)– представляют собой транспозируемые элементы. Это фрагменты ДНК длиной >1000 пар нуклеотидов. Их функции:

1. Содержание информации, крайне важной для транспозиции, ᴛ.ᴇ. перемещения в различные участки ДНК.

2. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и профагов между собой и с хромосомой бактериальной клетки.

3. Вызывать инактивацию, «выключение» определœенного гена.

4. Индуцировать мутации.

59. Основные отличия прокариот от эукариот. Формы бактерий с дефектом синтеза клеточной стенки.

Главное отличие

У прокариот нет ядра, кольцевая ДНК расположена прямо в цитоплазме (это нуклеоид). У эукариот есть оформленное ядро.

Дополнительные отличия

1) Раз у прокариот нет ядра, то нет и митоза/мейоза. Бактерии размножаются делением надвое.

2) У прокариот рибосомы мелкие (70S), а у эукариот – крупные (80S). 3) У эукариот имеется множество органоидов.

4) Клетка прокариот гораздо меньше клетки эукариот: по диаметру в 10 раз, по объему – в 1000 раз.

Формы бактерий с дефектом синтеза клеточной стенки

При действии пенициллина на растущую бак. культуру образуются безоболочечные формы бактерий:

1 Пртопласты- полностью лишены КС.

2.Сферопласты- частично лишены КС

И протопласты, и сферопласты подвергаются плазмолизу в изотонической среде, н в пшерюнической среде проявляютслабую метаболическую активность, ! утрачивают способность к размножению.

3.L- формы- полностью или частично лишены КС, сохраняют способность к размножению.

а) стабильные- способны к реверсии в исходный вид.

б) нестабильный-не способны к реверсии

60. Сложные методы окраски, их характеристика, примеры.

Метод Грамма. Он позволяет выявить структуры клеточных стенок и химические особенности бактерий. Грамположительно в фиолетовый цвет окрашиваются бактерии, у которых клеточная стенка содержит много слоев пептидогликана, цитоплазма бактерий окрашивается в фиолетовый цвет. Примеры грамположительных бактерий - стафилококки, стрептококки, микобактерии, возбудитель дифтерии и др.

Техника окраски

1. Препарат залить генцианвиолетом – 3-4 мин.

2. затем раствором люголя – 2 мин.

3. обесцветить спиртом – 15-20 сек.

4. Промыть водой.

5. докрасить фуксином водным 2-3 мин.

6. Смыть краску водой, препарат просушить фильтровальной бумагой.

Метод Бурри-Гинса применяется для обнаружения капсул.

капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Для выявления капсулы по методу Бурри-Гинса культуру бактерий смешивают на предметном стекле с тушью, мазок высушивают, фиксируют и докрашивают обычным фуксином. При этом на черном фоне капсулы видны светлыми ореолами вокруг розовых бактерий. Например: пневмококки, возбудитель чумы, сибирской язвы и др.

Метод Циля-Нильсенаприменяется для выявления бактерий и спор, обладающих кислотоустойчивостью. Поэтому препараты сначала протравливают кислотой (метод Ожешка) и окрашивают при подогревании краски основным карболовым фуксином Циля (метод Циля-Нильсена). Затем препарат обесцвечивают серной кислотой и докрашивают метиленовой синькой. При этом кислотоустойчивые бактерии и споры окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые элементы и бактерии - в синий.

61. Работы Коха, их роль в развитии микробиологии.

1-введение в практику анилиновых красителей

2- использование в микроскопии иммерсионной системы и конденсора

3- разработка метода культивирования на биологических жидкостях и плотных питательных средах

4- разработка метода дробных пересевов

5- открытие возбудителя сибирской язвы, холеры, туберкулеза и туберкулина.

6. «триады Генле — Коха». Суть триады: 1) предполагаемый микроб-возбудитель всегда должен обнаруживаться только при данном заболевании, не выделяться при других болезнях и от здоровых лиц; 2) микроб-возбудитель должен быть выделен в чистой культуре; 3) чистая культура данного микроба должна вызвать у экспериментальных зараженных.

7. метод выделения чистых культур бактерий на твердых питательных средах.

62. Состав, функции, метод обнаружения капсул.

Капсула – это слизистое образование, обволакивающее клетку бактерии.

В зависимости от толщины, различают:

• Микрокапсулы – они толщиной менее 0,2 мкм, видимы лишь только под электронным микроскопом.

• Макрокапсулы – толщиной более 0,2 мкм (до 10 мкм), видны в световом микроскопе.

Химический состав капсулы: она на 98 % состоит из воды.

По химическому составу капсулы разделяют на: •Капсулы полисахаридной природы. • Капсулы, состоящие из полипептидов и полисахаридов.

Функции капсулы:

1. Защитная

2. Создает дополнительный осмотический барьер.

3. Для некоторых бактерий является источником запасных питательных веществ (азотобактера).

4. Для слипания клеток (зооглеи).

Выявление капсулы:

1. При обычных методах окраски капсулы видны. Для их выявления лучше использовать негативное контрастирование: добавление таких красителей, которые в капсулу не проникают (тушь, нигрозин, конго красный).

Наиболее распространен метод Бурри—Гинса:

– каплю туши и петлю исследуемого материала смешивают, готовят мазок при помощи стекла со шлифованным краем (как тонкий мазок крови), высушивают;

– фиксируют химически или физически;

– окрашивают водным фуксином 3-5 мин;

– промывают водой, высушивают, микроскопируют с масляной иммерсией: фон черный (тушевой), бактерии красные, капсулы неокрашенные (рис. 6).

2. В серологических реакциях с противокапсульными сыворотками.

3. При помощи реакции набухания капсулы Нейфельда: при добавлении гомологичных антисывороток капсулы становятся видимыми вследствие отложения белка антител.

4. Электронная микроскопия: капсула визуализируется в виде микрофибрилл из мукополисахаридов, которые тесно прилегают к КС.

Методы 2–4 позволяют выявлять микрокапсулу, которая не обнаруживается методом 1.

63. Споры. Стадии спорообразования. Метод окраски спор. Примеры патогенных спорообразующих бактерий.

спора - Покоящаяся форма, позволяющая сохранить наследственную информацию бактериальной клетки в неблагоприятных условиях внешней среды

Функция:Защита от неблагоприятных физико-химических факторов внешней среды, истощения питательной среды

Место образования внешняя среда (не в организме человека), искусственная питательная среда

Факторы, обуславли- вающие термоустой- чивость

• практически полное отсутствие свободной воды

• повышенная концентрация кальция

• наличие дипиколиновой кислоты

• особое строение белка

особое строение пептидогликана кортекса

Выявление Окраска по Цилю-Нильсену или по Ожешко

Окраска по Цилю-Нильсену для выявления бактерий и спор:

1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый фуксин Циляи над пламенем спиртовки подогревают препарат 2-3 раза до появления паров.Необходимо для размягчения оболочки споры («протравливания»).

2. Бумагу снимают, препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты.

Промывают водой и докрашивают метиленовым синим.

Результат:споры (и кислотоустойчивые бактерии) прокрашиваются в красный цвет. Кислотоподатливые бактерии и цитоплазма обесцвечиваются из-за особенностей химического состава и приобретают голубой (синий) цвет.

Окраска по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор соляной кислоты при подогревании

2. Промывают и фиксируют в пламени спиртовки.

3. Окраска по Цилю-Нильсену.

Результат микроскопии: споры – красные, вегетативные клетки – синие.

64. Химиотерапия, определение. Химиотерапевтический индекс. Работы Эрлиха и Домагка.

Химиотерапевтические препараты – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным (действующим на причину) действием.

По направленности действия химиотерапевтические препараты делят на:

1) противопротозойные;

2) противогрибковые;

3) противовирусные;

4) антибактериальные.

По химическому строению выделяют несколько групп химиотерапевтических препаратов:

1) сульфаниламидные препараты. Они нарушают процесс получения микробами необходимых для их жизни и развития ростовых факторов – фолиевой кислоты и других веществ. К этой группе относят стрептоцид, норсульфазол, сульфаметизол, сульфометаксазол и др.;

2) производные нитрофурана. Механизм действия состоит в блокировании нескольких ферментных систем микробной клетки. К ним относят фурацилин, фурагин, фуразолидон, нитрофуразон и др.;

3) хинолоны. Нарушают различные этапы синтеза ДНК микробной клетки. К ним относят налидиксовую кислоту, циноксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин;

4) азолы – производные имидазола. Ингибируют биосинтез стероидов, что приводит к повреждению наружной клеточной мембраны грибов и повышению ее проницаемости. К ним относят клотримазол, кетоконазол, флуконазол и др.;

5) диаминопиримидины. Нарушают метаболизм микробной клетки. К ним относят триметоприм, пириметамин;

6) антибиотики – это группа соединений природного происхождения или их синтетических аналогов.

химиотерапевтический индекс - показатель широты терапевтического действия химиотерапевтического средства, представляющий собой отношение его минимальной эффективной дозы к максимальной переносимой.

Домагк положил начало применению сульфаниламидов в медицинской практике.

ПАУЛЬ ЭРЛИХ (1854 - 1915) положил начало учению об антите­лах как Факторах гуморального иммунитета.

65 Окраска по Бурри-Гинсу. Методика, учет.

Методика окраски по Бурри-Гинсу.Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.

1. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.

2. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.

3. Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.

4. Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.

66 Лекарственная устойчивость бактерий, механизмы ее возникновения, профилактика.

В основе развития лекарственной устойчивости к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам лежат мутации хромосомных генов или приобретение плазмид лекарственной устойчивости. Антибиотикорезистентность — это устойчи­вость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистент­ными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной. Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Генетические основы приобретенной резис­тентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в попу­ляции бактерий в результате: мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) му­тантов, переноса трансмиссивных плазмид резис­тентности (R-плазмид), переноса транспозонов, несущих r-гены.

Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и прой­ти сквозь ее оболочку, затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего пре­парат взаимодействует с внутриклеточными мишенями.

Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически не­возможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и рас­пространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показа­ниям, избегать их использования с профи­лактической целью, через 10—15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по воз­можности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использо­вать их как фактор роста).

67 Антибиотики, классификация. Механизмы действия на бактериальную клетку.

 Антибиотики —  группа  соединений природного  происхождения или их полусинтетических и синтетических аналогов, обладаю­щих антимикробным или противоопухолевым действием.

По химической структуре:

1) b- лактамиды – пенициллин, цефалоспорины и др.;

2) макролиды – эритромицин, олеандомицин;

3) аминогликозиды – стрептомицин, канамицин, гентамицин;

4) тетрациклины – окситетрациклин, доксициклин;

5) полипептиды – полимиксины, бацитрины;

6) полиены – нистатин, амфотерицин В;

7) рифимпицины– рифампицин; рифамицин

8) Левомицетины – левомицетин,

По происхождению антибиотики делят 5 классов:

1) из грибов – пенициллин;

2) из бактерий – субтилин, грамицидин;

3) из актиномицетов – стрептомицин;

4) из тканей животных – лизоцим, интерферон;

5) из растений – хлорофилипт из эвкалипта, аллилчеп – из лука, аллилсат – из чеснока, из лишайников – усниновая кислота.

Антибиотики могут быть получены и путем химического синтеза.

По спектру действия :

1) антибактериальные широкого (тетрациклины, левомицетин) и узкого (полимиксин, бензилпенициллин) спектра действия;

2) противогрибковые широкого (амфотерицин В) и узкого (нистатин) спектра действия;

3) противопротозойные – против простейших ( фумагиллин – антибиотик узкого спектра действия – против амеб);

4) противоопухолевые – препараты, обладающие цитотоксическим действием (рубомицин).

5)противовирусные –ремонтадин, ацикловир.

По механизму действия:

1) угнетают синтез белков клеточной стенки (b-лактамы – пенициллины, цефалоспорины);

2) нарушают синтез клеточной мембраны (полиены – нистатин; полимиксины)

3) ингибируют синтез белков (тетрациклины, левомицетин, аминогликозиды - – стрептомицин, мономицин, неомицин, канамицин, гентамицин);

4) ингибируют синтез нуклеиновых кислот ( протитвоопухолевые антибиотики: актиномицин подавляет синтез РНК, рубомицин – синтез ДНК).

По способу получения:

- природные(бензилпеницилин)

-синтетические(левомицетин)

-полусинтетические(карбенициллин)

По конечному эффекту:

-бактерицидные(пеницилин)

-бактериостатические(левомицетин)

По спектру действия:

-препараты широкого спектра(тетрациклин)

-узкого спектра(пеницилин)

Основные механизмы действия антибиотиков: нарушение бактериальной клеточной стенки; подавление синтеза белка в микробной клетке; нарушение проницаемости цитоплазматической мембраны; торможение синтеза РНК.

Высокая избирательность действия антибиотиков на микроорганизмы при их малой токсичности в отношении макроорганизма, очевидно, объясняется особенностями структурной и функциональной организации микробных клеток. Действительно, клеточная стенка бактерий по химическому составу принципиально отличается от мембран клеток млекопитающих. Состоит клеточная стенка бактерий из мукопептида муреина (содержит N-ацетил-глюкозамин, N-ацетил-мурамовую кислоту и пептидные цепочки, включающие некоторые L- и D-аминокислоты). В связи с этим вещества, нарушающие ее синтез (например, пенициллины), обладают выраженным антимикробным действием и практически не влияют на клетки макроорганизма. Определенную роль, возможно, играет неодинаковое количество мембран, окружающих те 1 активные центры, с которыми могут взаимодействовать антибиотики. 

68 Состав и назначение среды Китта-Тароци.

Питательная среда Китта-Тароци предназначена для культивирования облигатно-анаэробных бактерий, преимущественно клостридий, в том числе возбудителей анаэробной газовой инфекции. Состоит из мясопептонного бульона, обогащенного экстрактивными продуктами печени животных и содержащего кусочки вываренной печени в качестве поглотителя свободного кислорода.

69 Классификация бактерий по способу дыхания.Примеры.

Облигатные аэробы (возбудители туберкулеза, чумы, холеры) – микроорганизмы, для оптимального роста которых необходимо 21 % кислорода.

Облигатные анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии) – бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода.

Факультативные анаэробы (стафилококки, ешерихии, сальмонели, шигели и другие) – приспособились, в зависимости от условий среды (наличию или отсутствию кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот.

Микроаэрофилы (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии) – особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост.

Капнеические (возбудитель бруцеллеза бычьего типа) – микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа.

70 Питательные среды для бактерий, классификация, требования. Приготовление простых и сложных питательных сред.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Основные требования, предъявляемые к питательным средам:

1. Питательные среды должны содержать все необходимые для питания микроба питательные вещества, т.е. обладать питательностью.

2. Иметь достаточную влажность

3. Иметь оптимальную рН (7,2-7,6) кислотность среды.

4. Обладать изотоничностью (концентрация NaCl0,87%), для галофильных бактерий концентрация соли 1% и выше.

5. Иметь оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

6. Быть прозрачными, чтобы был виден рост бактерий, особенно в жидких средах.

7. Быть стерильными (чтобы не было других бактерий).

Классификация питательных сред:

1. По происхождению:

1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);

2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);

3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений.

2. По составу:

1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон;

2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточный агар, желточно-солевой агар, среда Китта—Тароцци.

3. По консистенции:

1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);

2) полужидкие (0,15—0,7 % агар-агара);

3) жидкие (не содержат агар-агара).

4)сыпучие

5)сухие

4. По назначению:

1) общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар);

2) специального назначения:

а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (щелочной бульон, 1 %-ная пептонная вода, желточно-солевой агар, казеиново-угольный агар и др.);

б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среда Эндо, Левина, Гиса, Плоскирева и др.);

в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида (селенитовный бульон).

г)селективные- спец.добавки благод. которым рост одних микроорг. повышается, других-подавляется.

Приготовление

К простым средам относятся мясопептонный бульон, мясопептонный агар, мясопептонный желатин (МПЖ). Все простые питательные среды готовят на мясной воде. Для ее приготовления мясо отделяют от жира и фасций, измельчают, заливают водой в соотношении 1:2 и кипятят в течение 30-60 мин.

Сложные (специальные) питательные среды готовят для культивирования микробов, которые не растут на обычных, простых средах. Например, яичную среду Петраньяни используют для выращивания туберкулезной палочки. В состав среды входят молоко, картофельная мука, пептон, яичный белок, 2 %-ный водный раствор малахитовой зелени.

К сложным питательным средам относятся дифференциально-диаг­ностические среды (Эндо, Плоскирева и др.), которые служат для отличия одних групп или видов микробов от других. Например, среда Эндо состоит из МПА, лактозы, фуксина основного, обесцвеченного щелочью.

71 Среда Ресселя, ее характеристика.

Среду используют для дифференциации грамотрицательных бактерий кишечной группы по их способности ферментировать глюкозу и лактозу с образованием газа или без него.

Приготовление:

Тщательно размешать 44,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Разлить среду в необходимом количестве в пробирки. Стерилизовать автоклавированием при 0,9-1,1 атм (118-121°С) в течение 15 мин. Остудить в наклонном положении для формирования скошенной части и столбика.

Оценка: Эту среду используют для дифференциации грамотрицательных бактерий кишечной группы, особенно эшерихий, сальмонелл и шигелл, по их способности ферментировать глюкозу и лактозу. Образование кислоты в ходе инкубирования определяют по изменению цвета индикатора фенолового красного в скошенной части (аэробная ферментация) и в столбике среды (анаэробная ферментация). На образование газа в ходе ферментации указывают пузырьки и разрывы среды в столбике. Такие микроорганизмы, как Salmonella typhi, ферментируют глюкозу, но не лактозу, поэтому сначала на короткое время скошенная часть закисляется. По мере расхода глюкозы в аэробных условиях выделяющиеся амины снова защелачивают среду. В анаэробных условиях (в столбике) среда остается кислой.

72 Распространение фагов в природе. Титрование фагов. Применение фагов в медицине.

Фаги широко распространены в природе. Выделить их можно из различных субстратов, в которых имеются микробы — хозяева фагов. Кишечные фаги можно выделить из сточных вод, почвы, испражнений, стафилококковые фаги — из слизи носа, зева, с кожных покровов, из отделяемого ран. В настоящее время известны фаги почти у всех патогенных и многих непатогенных микроорганизмов: у бактерий семейства кишечных, коринебактерий, микобактерий, стрептококков, споровых микроорганизмов, актиномицетов. Фаги и подобные им агенты не обнаружены у простейших, большинства дрожжей, плесневых грибов, спирохет, водорослей.

Титрование бактериофага. После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание или, как принято говорить, найти титр фага.

Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: количеством активных корпускул бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемой жидкости бактериофага, или величиной наибольшего разведения исследуемой жидкости, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага. Средний титр бактериофага составляет 10.

Для титрования бактериофага предложены различные методы, однако наибольшее распространение получили способ титрования фага в жидкой питательной среде, предложенный Аппельманом, и метод агаровых слоев Грациа.

Применение бактериофагов в медицине.Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие. Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего ДНК. Размножение бактериофага возможно только в живых клетках. Бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур. С помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий была показана возможность изучения этапов взаимодействия бактериофагов и микроорганизмов.

73 Дыхание бактерий. Типы, источники энергии. Способы культивирования строгих анаэробов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. По типу дыхания выделяют:

1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO₂, например до 10- процентной концентрации.

3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным).

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.

Физические методы.Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

Химические методы.Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄.

Биологические методы.Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы.Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

74 Алгоритм выделения чистой культуры анаэробов.

1. Материал засевается на среду Китт – Тароцци, затем: а) сразу же прогревается на водяной бане при 80 градусах в течение 20 минут (для уничтожения факультативных анаэробов); б) после прогревания посевы помещают в термостат на 24 часа при 37 градусах ( для прорастания спор и накопления массы микробных клеток). 2.Посевы извлекают из термостата и подвергают исследованию: а) макроскопически определяют наличие микробных клеток (по помутнению питательной среды); б) проводят микроскопическое исследование (в приготовленном микропрепарате, окрашенном по Грамму, отмечается наличие грамположительных палочковидных бактерий). 3.Производят отсев со среды Китт – Тароцци для получения изолированных колоний по методу Цейслера или Вейнберга.