Антитела

В процессе эволюции организмы выработали набор защитных приспособлений к патогенным микроорганизмам, включающие неспецифические механизмы, препятствующие проникновению патогенов, вещества неспецифически повреждающие их (лизоцим, комплемент), фагоцитоз и другие клеточные реакции. Вместе с тем, патогенные микроорганизмы тоже научились преодолевать неспецифические барьеры. Поэтому в процессе эволюции появились специфические гуморальные факторы защиты в виде антител и способность организма к выраженному специфическому иммунному ответу.

Антитела – белки, относящиеся к иммуноглобулинам, которые синтезируются лимфоидными и плазматическими клетками в ответ на попадание в организм антигена, обладающими способностью специфически связываться с ним. Антитела составляют более 30% белков сыворотки крови, обеспечивают специфичность гуморального иммунитета благодаря способности связываться только с тем антигеном, который стимулировал их синтез.

Первоначально антитела условно классифицировали по их функциональным свойствам на нейтрализующие, лизирующие и коагулирующие. К нейтрализующим были отнесены антитоксины, антиферменты и вируснейтрализующие лизины. К коагулирующим – агглютинины и преципитины; к лизирующим – гемолитические и комплементсвязывающие антитела. С учетом функциональной способности антител были даны названия серологическим реакциям: агглютинация, гемолиз, лизис, преципитация и др.

В соответствии с Международной классификацией сывороточные белки, несущие функцию антител, получили название иммуноглобулинов (Ig). В зависимости от физикохимических и биологических свойств различают иммуноглобулины классов IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Иммуноглобулины – белки с четвертичной структурой, т. е. их молекулы построены из нескольких полипептидных цепей. Молекула каждого класса состоит из четырех полипептидных цепей – двух тяжелых и двух легких, связанных между собой дисульфидными мостиками. Легкие цепи – структура общая для всех классов иммуноглобулинов. Тяжелые цепи имеют характерные структурные особенности, присущие определенному классу, подклассу.

Антитела, входящие в определенные классы иммуноглобулинов, обладают различными физическими химическими, биологическими и антигенными свойствами.

Иммуноглобулины содержат три вида антигенных детерминант: изотипические (одинаковые для каждого представителя данного вида), аллотипические (детерминанты, различные у представителей данного вида) и идиотипические (детерминанты, определяющие индивидуальность данного иммуноглобулина и являющиеся различными у антител одного класса, подкласса). Все указанные антигенные различия определяются с помощью специфических сывороток.

Синтез и динамика образования антител

Антитела вырабатывают плазматические клетки селезенки, лимфатических узлов, костного мозга, пейеровых бляшек. Плазматические клетки (антителопродуценты) происходят из предшественников В-клеток после их контакта с антигеном. Механизм синтеза антител аналогичен синтезу любых белков и происходит на рибосомах. Легкие и тяжелые цепи синтезируются отдельно, затем соединяются на полирибосомах, а окончательная их сборка происходит в пластинчатом комплексе.

Динамика образования антител. При первичном иммунном ответе в антителообразовании различают две фазы: индуктивную (латентную) и продуктивную. Индуктивная фаза – это период от момента парентерального введения антигена до появления антигенреактивных клеток (продолжительность не более суток). В эту фазу происходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток в направлении синтеза IgM. Вслед за индуктивной фазой наступает продуктивная фаза антителообразования. В этот период, примерно до 10…15 суток уровень антител резко возрастает, при этом уменьшается число клеток, синтезирующих IgM, и нарастает продукция IgA.

Феномен взаимодействия антиген-антитело.

Знание механизмов взаимодействия антигенов и антител раскрывает сущность многообразных иммунологических процессов и реакций, возникающих в организме под влиянием патогенных и непатогенных факторов.

Реакция между антителом и антигеном протекает в две стадии:

- специфическая - непосредственное соединение активного центра антитела с антигенной детерминантой.

- неспецифическая – вторая стадия, когда, отличающийся плохой растворимостью иммунный комплекс выпадает в осадок. Эта стадия возможна в присутствии раствора электролита и визуально проявляется по разному, в зависимости от физического состояния антигена. Если антигены корпускулярные, то имеет место феномен агглютинации (склеивания различных частиц и клеток). Образующиеся конгломераты выпадают в осадок, при этом клетки морфологически не изменяются, теряя подвижность, они остаются живыми.

Учение об иммунитете является не только теоретическим, но и сугубо практическим разделом биологии, медицины, ветеринарии. На основании серологических реакций, при помощи которых выявляют специфические антитела, строится диагностика инфекционных заболеваний. На основании иммунологических закономерностей разрабатываются средства специфической профилактики и терапии инфекционных заболеваний (вакцины и сыворотки). На основании этих закономерностей осуществляются переливание крови, трансплантация органов и тканей и многие другие лечебные и профилактические мероприятия.

Для диагностики бруцеллеза у дойных коров используют кольцевую реакцию агглютинации с молоком. Сущность ее состоит в том, что при наличии в молоке специфических антител (агглютининов) происходит склеивание окрашенного бруцеллезного антигена (убитых клеток возбудителя), образовавшийся агглютинат поднимается вместе со сливками вверх пробирки, образуя окрашенное кольцо (при обесцвечивании остальной части молока).

Антитела, содержащиеся в молозиве в больших количествах, поступая в организм новорожденного, создают колостральный пассивный иммунитет, защищающий организм от кишечных и других инфекций.

Антитела молока являются одним из факторов, обусловливающих бактерицидную фазу молока, т.е. подавляют развитие микроорганизмов в молоке.

При маститах (воспалении молочной железы) резко увеличивается количество лейкоцитов в молоке, повышается их фагоцитарная активность, что используется при диагностике субклинических форм маститов и выявлении маститного молока.

 40. Серологические реакции(РА,РП.юРСК)

Реакции между антигенами и антителами in vitro или серологические реакции применяют для определения антигенов или антител по одному известному реагенту. В серологических реакциях можно установить титр антител в сыворотке крови при помощи известного антигена и на основании полученных данных судить об имевшем место контакте между инфекционным агентом и макроорганизмом. С помощью известных антитея, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе микроорганизмы — возбудители заболеваний людей и животных, и определен их серовариант (серовар). Серологические реакции дают возможность судить о динамике накопления антител в процессе заболевания, напряженностл иммунитета, возникающего после предохранительных прививок. Таким образом, серологические реакции в диагностических целях применяются в двух направлениях:

1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для определения неизвестных антител с помощью известного антигена, и

2) для определения вида антигена (микроба) или его серовара с помощью известных диагностических антисывороток.

Серологические реакции характеризуются двумя показателями — специфичностью и чувствительностью. Под специфичностью понимают способность антигена реагировать только с гомологичными антителами. Чувствительность — это возможность определения минимальных количеств антигена или антител Внешнее проявление реакции зависит от физического состояния антигена и условий ее постановки. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые антигены — преципитацию. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinatio — склеивание) проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также химических частиц с адсорбированными на нихйиггигенами под влиянием антител в среде с електролитом. Реакция протекает в две фазы В первой фазе проходит специфическая адсорбция антител (агглютининов) на поверхности клетки, несущей соответствующие антигены (агглютиногены), во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадание его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор натрия хлорида).

Реакция агглютинации достаточно специфична и чувствительна. Однако по данным признакам она уступает другим серологическим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором еще обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Для отличия положительной реакции за счет ранее перенесенной инфекции или вакцинации от протекающего заболевания определяют динамику нарастания титра антител, которая наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий групповых и тйпоспецифических антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой за счет антител к групповым антигенам, что 'затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных гетерогенных бактерий (антигенов) адсорбировать из антисыворотки только групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических антител., Полученные сыворотки называются монорецепторййми, так как содержат антитела только к одному антигенному рецептору. Они применяются для детального изучения айтигенной структуры бактерий с целью определения их серовара.

Реакция непрямой, или пасивной,агглютинации(РГНА).

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитело агглютинирует антиген, предварительно адсорбированный на различных субстратах. В качестве адсорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, порошок целлюлозы и бентонита. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т. е. адсорбируют не антигены, а антитела на эритроцитах иди иных частицах. РНГА нашла широкое применение в серодиагностике различных инфекций, а также для идентификации многих микроорганизмов благодаря очень высокой чувствительности и специфичности.

Реакция преципитации

Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена (преципитиногена), находящегося в дисперсном коллоидном состоянии под воздействием специфических антител (преципитинов) в растворе электролита. Механизмы реакций агглютинации и преципитации аналогичны и соответствуют теории «решетки».

Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаруживать ничтожные количества антигена. Так, например, противопневмококковая сыворотка преципитирует полисахарид пневмококка при его разведении в 1 мли. раз. Такая высокая чувствительность реакции преципитации позволила использовать ее для определения антигенов по известным антисывороткам. Для этого последовательные разведения антигена наслаивают на стандартные разведения диагностической сыворотки в пробирках. Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается преципитация.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики сибирской язвы (реакция Асколи), туляремии и других заболеваний, а также в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка, в частности белка кровяных пятен, спермы и т.д. С помощью этой реакции в санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий. В биологии реакция преципитации используется для установления степени филогенетического родства различных видов животных и растений. Феномен преципитации дает возможность изучить антигенную структуру бактерий и сложных белков, содержащихся в сыворотке крови и тканях животных. Реакции ставят в различных модификациях: в пробирках, в геле и т. д. При постановке реакции в геле антигены и антитела, диффундируя в агар, образуют линии преципитации.

Реакция гемолиза.

Под влиянием антител и комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — лаковую кровь вследствие выхода гемоглобина. Реакция широко применяется в лабораторной серологической практике в качестве показателя адсорбции комплемента при постановке диагностиче-ской реакции связывания комплемента (РСК). Для реакции гемолиза используют эритроциты барана (антиген), гемолитипескую сыворотку, полученную путем гипериммунизации кроликов тем же антигеном, и комплемент — сыворотку крови морской свинки.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне). Эта реакция является одним из вариантов гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток в лимфоидных органах. Присутствие клеток, секретирующих гемолитические антитела — гемолизи-ны, определяют по бляшкам гемолиза, возникающим в агаровом геле, содержащем эритроциты, при добавлении к ним исследуемой лимфо-идной ткани и комплемента. Образование бляшек наблюдается только вокруг тех клеток, которые секретируют антитела к эритроцитам или к тому антигену, который был предварительно адсорбирован на них.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу (1901), которые установили, что при образовании комплекса антиген — антитело происходит адсорбция комплемента. Вследствие того что этот процесс не определяется визуально, для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы использовали индикаторную гемолитическую систему — эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической антисывороткой кролика. При внесении сенсибилизированных эритроцитов в пробирку с исследуемой сывороткой, антигеном и комплементом гемолиз произойдет только при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, если комплемент адсорбировался на системе антиген — антитело, гемолиза не будет (реакция положительная).

РСК является одной из наиболее распространенных серологических реакций для определения природы и количества антител или антигенов ввиду своей высокой чувствительности и специфичности. Она применяется для серодиагностики бактериальных, риккетсиозных, вирусных и микоплазменных инфекционных заболеваний. Под названием «реакция Вассермана» РСК нашла широкое применение для серодиагностики сифилиса. Ее универсальность состоит в том, что она может быть использована для определения не только микробных айтигенов, но и других белков любого происхождения.

Реакция иммобилизации

Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях. Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция торможения гемагглютинации

Как уже отмечалось, многие вирусы (ортомиксовирусы, арбовирусы и др.) могут адсорбироваться на поверхности эритроцитов. Это изменяет поверхностные структуры и приводит к агглютинации эритроцитов. Реакция гемагглютинации не является иммунологической, поскольку она протекает без участия антисыворотки.

РТГА основана на способности антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный вирус не агглютинирует эритроциты.

РТГА широко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (антигенам).

Реакция иммунофлюоресценции (Кунса).

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологическом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактериям, вирусам и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеина и др.). Меченую антисыворотку наносят на фиксированный мазок, приготовленный из исследуемого материала. После тщательного промывания мазка на нем останутся только антитела, связавшиеся с антигеном, которые дают характерное свечение при люминесцентной микроскопии (прямой метод).

В связи с трудностями, которые встречаются при приготовлении широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, более доступным является непрямой метод Кунса. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, так как большинство диагностических сывороток приготовляется путем иммунизации кроликов. При образовании комплекса антиген — антитело флюоресцирующие антиглобулиновые антитела фиксируются на нем. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чувствительности и специфичности не уступает другим иммунологическим реакциям.