III. Содержание отчета.
Отчет должен быть представлен на отдельных листах формата А4 или в альбоме.
Отчет должен содержать:
1. Цель работы.
2. Краткое описание теории сперматогенеза, овогенеза, строения гамет.
3. Результаты исследований (микроскопическое изучение препаратов) и их анализ (с указанием использованных микроскопов, их увеличения, других приборов и материалов).
4. Результаты выполнения индивидуального задания (определение и описание «слепого» препарата).
5. Выводы.
Отчет на листе формата А4 сдается в конце работы преподавателю.
IV. Контрольные вопросы.
1. Какие части различают в сперматозоиде?
2. Что такое акросома и какую роль она играет?
3. Каковы принципы классификации яйцеклеток?
4. Дайте характеристику фаз прогенеза.
5. В чем отличие мужского и женского гаметогенеза?
Рекомендуемая литература.
1. А.В.Белоусов. Биология индивидуального развития, 1983.
2. Т.М.Студеникина. Основы общей эмбриологии, 1999.
3. О.В.Волкова. Атлас. Гистология, цитология, эмбриология, 1996.
4. С.Л.Кузнецов. Атлас эмбриологии, 2002.
Лабораторное занятие № 2. Оплодотворение и ооплазматическая сегрегация.
Цель работы: изучить общую характеристику процесса оплодотворения и его биологическое значение; рассмотреть стадии оплодотворения; ознакомиться с современными представлениями о механизмах активации яйцеклетки.
Оборудование, приборы и принадлежности: таблицы, микроскопы, микропрепараты, схемы, планшеты.
I. Теоретическая часть.
1. Общая характеристика процесса оплодотворения.
Оплодотворением называют слияние гаплоидного сперматозоида с гаплоидной яйцеклеткой, завершающееся объединением их ядер в единое диплоидное ядро оплодотворенного яйца – зиготы. В процессе оплодотворения сперматозоид выполняет две функции. Первая – активация яйца, побуждение его к началу развития. Эта функция не специфична для сперматозоида: в качестве активирующего фактора он может быть заменен рядом физических или механических агентов, способных спровоцировать развитие зародыша. Развитие яйцеклетки без участия сперматозоида называется партеногенезом. Другая функция сперматозоида, в выполнении которой он уже незаменим, – внесение в яйцеклетку отцовского генетического материала.
Взаимодействие половых клеток (гамет) в процессе оплодотворения можно разделить на три фазы: 1) дистантное взаимодействие, осуществляющееся на некотором расстоянии, до соприкосновения гамет; 2) контактное взаимодействие, происходящее при непосредственном соприкосновении поверхностей гамет; 3) процессы, протекающие после вхождения сперматозоида в яйцо (рис. 2.1).
Рис. 2.1. Процесс оплодотворения.
А – фаза дистантного взаимодействия; Б, В, Г – фаза контактного взаимодействия;
Д, Е, Ж, З – фаза синкариона. 1 – мембрана яйца; 2 – студенистая оболочка; 3 – бугорок оплодотворения; 4 - оболочка оплодотворения; 5 – центриоль.
1.1. Дистантное взаимодействие гамет направлено на повышение вероятности встречи сперматозоидов с яйцеклеткой. По большей части эти взаимодействия осуществляются через посредство хемотаксиса – движения сперматозоидов по градиенту концентрации некоторых веществ, выделяемых яйцеклеткой. Наличие хемотаксиса достоверно установлено для многих групп животных, особенно беспозвоночных: книдарий, моллюсков, иглокожих и полухордовых.
В движении сперматозоидов млекопитающих по верхним отделам яйцевода существенное значение имеет явление реотаксиса (способность двигаться против встречного тока жидкости в маточных трубах).
1.2. Контактное взаимодействие гамет начинает осуществляться с момента контакта сперматозоида с оболочками яйцеклетки (рис. 2.2). Первый этап этих взаимодействий получил название акросомной реакции. Иногда эта реакция может быть вызвана не только контактом с блестящей оболочкой яйцеклетки, но также соударением сперматозоида с любой твердой поверхностью или же при повышении концентрации Са2+. Внешнее, видимое при небольших увеличениях проявление этой реакции—выброс так называемой акросомной нити в сторону яйцевой оболочки. Тонкие электронно-микроскопические исследования сперматозоидов, фиксированных в период выбрасывания акросомной нити, показали следующее.
Рис. 2.2. Последовательные стадии соединения спермия с яйцом.
А. Б – раскрытие акросомного пузырька; В, Г – высвобождение лизирующих ферментов акросомы;
Д, Е – образование бугорка оплодотворения
Процесс начинается со слияния мембраны акросомы с наружной мембраной сперматозоида. Затем слившиеся мембраны разрываются, и происходит экзоцитоз содержимого акросомного пузырька. При этом из него изливаются спермолизины—ферменты, растворяющие оболочку яйцеклетки. После этого внутренний участок мембраны акросомы начинает быстро выпячиваться, в результате чего образуется одна или целый пучок так называемых акросомных трубочек (или микроворсинок), которые и выглядят при малом увеличении как нити. Акросомная микроворсинка растет в результате быстрой сборки фибриллярного сократительного белка актина, образующего ее структурную основу. Момент соприкосновения акросомной микроворсинки с блестящей оболочкой яйцеклетки — решающий для взаимного узнавания яйцeклeтки и сперматoзoидa.
Это узнавание осуществляется, в случае «правильной» встречи сперматозоида с яйцеклеткой того же вида, благодаря комплементарному взаимодействию особого белка (биндина), встроенного в мембрану акросомной микроворсинки (бывшая внутренняя мембрана акросомного пузырька) с соответственным рецептором на оболочке яйцеклетки. Даже у близких между собой видов биндины различаются по составу. Заключенные, таким образом, до акросомной реакции внутри акросомного пузырька биндины экспонируются (становятся доступными) для связывания рецепторами благодаря выворачиванию и росту акросомной микроворсинки.
Вслед за реакцией узнавания (образования комплекса между биндином и его рецептором в блестящей оболочке) оболочка яйцеклетки лизируется, после чего на ней образуется бугорок оплодотворения, направленный навстречу акросомной микроворсинке. Этот момент считается началом процесса активации яйцеклетки. Формирование бугорка оплодотворения, как и акросомной микроворсинки, сопровождается полимеризацией актина. Мембраны верхушки акросомной микроворсинки и бугорка оплодотворения сливаются между собой, и по образовавшемуся сквозному каналу содержимое сперматозоида (прежде всего ядро и по крайней мере одна из центриолей, но нередко также и хвостовая часть) переходит внутрь яйцеклетки. Участок мембраны сперматозоида встраивается в мембрану яйцеклетки и может сохраняться длительное время, иногда обнаруживаясь иммунологическими методами до стадии личинки (у морского ежа).
Быстрое повышение концентрации Са2+ также участвует в стимуляции синтеза белка и ДНК и обусловливает наиболее явный признак реакции активации яйцеклетки – экзоцитоз так называемых кортикальных альвеол (рис. 2.3). Это многочисленные пузырьки, содержащиеся в кортикальном (поверхностном) слое неоплодотворенной яйцеклетки. Со стимуляцией ионами Са2+ процессов экзоцитоза мы уже познакомились на примере экзоцитоза акросомного пузырька.
При экзоцитозе кортикальных альвеол из них высвобождаются в узкое пространство между плазматической мембраной яйцеклетки и плотно примыкающей к ней желточной оболочкой следующие вещества: 1) протеолитический фермент, разрывающий связи между плазматической мембраной и желточной оболочкой,— вителлиновая деламиназа; 2) протеолитический фермент, освобождающий осевшую на блестящей оболочке сперму от связей с этой оболочкой,— сперм-рецепторная гидролаза; 3) гликопротеид, втягивающий воду в пространство между желточной оболочкой и плазматической мембраной и вызывающий тем самым их расслоение: в результате между желточной оболочкой и плазматической мембраной яйцеклетки возникает обширное пространство, называемое перивителлиновым. Образование перивителлинового пространства — наиболее отчетливый признак активации яйцеклетки; 4) фактор, способствующий затвердеванию оболочки оплодотворения; 5) структурный белок гиалин, участвующий в формировании гиалинового слоя, располагающегося у многих яйцеклеток (например, морского ежа) над плазматической мембраной.
Рис. 2.3. Оплодотворение.
1, 2, 3 – стадии акросомной реакции; 5 – блестящая зона; 6 – перивителлиновое пространство;
7 – плазматическая мембрана; 8 – кортикальная гранула; 9 – вождение спермия в яйцеклетку;
10 – зонная реакция.
Одновременно происходит сборка и перераспределение элементов цитоскелета в кортикальном слое яйцеклетки. Кортикальный слой в результате приобретает сократимость, необходимую для осуществления делений дробления. Образование оболочки оплодотворения надежно предохраняет яйцеклетку от проникновения излишних сперматозоидов — полиспермии.
В первые секунды после контакта гамет резко повышается проницаемость плазматической мембраны яйцеклетки для внешнего Na+, что приводит к падению трансмембранного потенциала яйцеклетки от отрицательного (порядка —60 мВ) до слабо положительного (около +10 мВ). Это падение потенциала осуществляет так называемый быстрый блок полиспермии, так как в яйцеклетки с положительным трансмембранным потенциалом дополнительные сперматозоиды проникнуть уже не могут.
Таким образом, активация яйцеклетки — чрезвычайно быстрая и широкая по охвату реакция, вовлекающая в себя буквально все компоненты яйца.
1.3. Сперматозоид внутри яйца (фаза синкариона).
У большинства животных сперматозоид входит в яйцеклетку целиком, включая хвостовую часть; у некоторых видов жгутик остается на поверхности. Но, и оказавшись внутри яйцеклетки, жгутик сперматозоида не играет никакой роли в дальнейшем движении последнего. Сперматозоид сразу же поворачивается шейкой по ходу дальнейшего движения; вокруг центриоли возникает характерное «полярное сияние», образованное микротрубочками. Хроматин в ядре сперматозоида деспирализуется. Ядро сперматозоида называют теперь мужским пронуклеусом. Хроматин ядра яйцеклетки после завершения делений мейоза тоже деспирализуется. Это ядро называется женским пронуклеусом.
Прежде чем сблизиться, пронуклеусы проделывают сложные движения («танец пронуклеусов»). Сначала мужской пронуклеус движется внутрь яйца перпендикулярно поверхности и независимо от положения женского пронуклеуса. Этот отрезок пути называют «дорожкой проникновения». Затем оба пронуклеуса движутся навстречу друг другу по «дорожке копуляции». Движение мужского пронуклеуса осуществляется, по-видимому, благодаря «отталкиванию» растущих микротрубочек полярного сияния от поверхностного слоя яйцеклетки.
После сближения пронуклеусов наступает кариогамия - объединение их хромосомных наборов. Кариогамия происходит всегда только после завершения яйцеклеткой делений созревания (у большинства животных именно вхождение сперматозоида в яйцеклетку стимулирует завершение этих делений). У тех немногих видов, где сперматозоид проникает в уже зрелую яйцеклетку (например, у морского ежа), кариогамия выражается в непосредственном слиянии пронуклеусов; образуется единое ядро зиготы. В тех случаях, когда между вхождением сперматозоида и кариогамией проходит более длительный срок, оболочки пронуклеусов растворяются еще до их сближения, и хромосомы спирализуются. Тогда кариогамия выражается в том, что хромосомы обоих пронуклеусов располагаются в одной плоскости—плоскости метафазной пластинки 1-го митотического деления оплодотворенного яйца.
2. Ооплазматическая сегрегация – перемещение компонентов яйца после оплодотворения и формирование специфических участков («полей»), детерминирующим в дальнейшем развитие определенных частей зародыша.
Непосредственно после проникновения сперматозоида (или воздействия партеногенетического агента) начинаются интенсивные перемещения цитоплазмы яйцеклетки (ооплазмы). Иногда при этом происходит расслоение, отмешивание различных составных частей ооплазмы, что обозначается как ооплазматическая сегрегация. В ходе этого процесса намечаются основные, хотя и далеко не все, элементы пространственной организации зародыша.