Рекомендовано к изданию НМС МГЭУ им. А.Д.Сахарова
(протокол № … от ... )
Рецензенты:
Доцент БГУ к.б.н. Глушен С.В.;
Ст.преподаватель МГЭУ им.А.Д.Сахарова Лозинская О.В.
Морозик М.С., Кокорина Н.В. Практикум по биологии индивидуального развития. Учебно-методическое пособие. Минск, МГЭУ им. А.Д.Сахарова, 2010 – 73 с.
Данное учебное пособие содержит учебно-методические материалы для проведения лабораторных работ по курсу «Биология индивидуального развития» со студентами второго курса. Для каждой лабораторной работы приводится перечень заданий, рисунки и схемы, описание препаратов, вопросы для подготовки к занятию, список рекомендуемой литературы.
Соответствует учебной программе по курсу «Цитология и гистология. Биология индивидуального развития» для студентов МГЭУ.
Министерство образования Республики Беларусь
Учреждение образования
«Международный государственный экологический университет
имени А. Д. Сахарова»
ПРАКТИКУМ
ПО БИОЛОГИИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
Минск, 2010
ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ № 1.
СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИЯ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК.
Цель работы: закрепить знания по строению гамет, этапам гаметогенеза и физиологии процессов, происходящих на этих этапах.
Дать характеристику и объяснение процессам, происходящим в мейотическую фазу развития половых клеток.
Оборудование, приборы и принадлежности: таблицы, микроскопы, микропрепараты, схемы, планшеты.
I. Теоретическая часть.
1. Строение половых клеток.
Половыми клетками (гаметами) являются мужская половая клетка сперматозоид и женская половая клетка – яйцеклетка. Половые клетки гаплоидны, т.к. образуются в результате редукционного деления мейоза.
1.1. Сперматозоид имеет все структуры, необходимые для обеспечения процесса оплодотворения: гаплоидное ядро с генетической информацией, заключенной в хромосомах, акросому – мембранную органеллу с ферментами, обеспечивающими проникновение ядра в яйцеклетку и двигательную систему, обеспечивающую перемещение ядра.
Двигательный аппарат у различных биологических видов различен, что зависит от условий окружающей среды. Так, у некоторых видов (например, аскариды) сперматозоид перемещается при помощи амебоидного движения. У большинства видов передвижение осуществляется благодаря биению жгутиков, преобразующих химическую энергию АТФ в механическую за счет ферментов (рис. 1.1).
Рис. 1.1. Сперматозоиды позвоночных:
I. А, Б – человека.
II. А – щуки; Б – саламандры; В – голубя; Г – ехидны; Д – полевой мыши.
Жгутиковый сперматозоид состоит из головки и хвостика, в котором различают связующий, промежуточный, главный и дистальный отделы.
На обычных гистологических препаратах ядра сперматозоидов обладают резко выраженной базофилий и имеют вытянутую грушевидную форму. Ядро характеризуется плотным расположением хроматина, в котором наряду с основными гистоновыми, обладающими положительным зарядом белками, находятся также негистоновые белки. ДНК хромосом в хроматине плотно упакована, поэтому ядро имеет кристаллоподобную структуру, его объем сведен до минимума. Ядерная оболочка сперматозоида полностью лишена ядерных пор.
В передней части ядра под цитолеммой сперматозоида находится акросома - производное комплекса Гольджи и аналог лизосомы, которая содержит ферменты, расщепляющие компоненты оболочек яйцеклетки.
Цитоплазма сперматозоида редуцирована до минимума и очень тонким слоем покрывает ядро.
Связующий отдел хвостика содержит проксимальную центриоль, которая прилежит к ядру, располагаясь в углублении ядерной оболочки. Здесь же находится дистальная центриоль. От нее отходит осевая нить - аксонема, имеющая типичную структуру жгутиков и состоящая из 9 периферических дуплетов микротрубочек и двух расположенных в центре одиночных микротрубочек. Аксонема продолжается во все отделы хвостика, редуцируясь в дистальном отделе. Снаружи напротив каждого дуплета дистальной центриоли в связующем отделе находится одна так называемая сегментированная колонна (всего их число равно 9).
В промежуточном отделе хвостика сегментированные колонны продолжаются в 9 плотных волокон. В этом же отделе вокруг аксонемы и плотных волокон в виде спирали располагаются митохондрии. В главной части хвостика два из девяти плотных волокон, расположенные напротив друг друга, резко утолщаются и превращаются в продольные столбы, которые соединяются между собой боковыми ребрами. Формируется внешняя волокнистая оболочка, придающая жесткость и упругость хвостику. Таким образом, сегментированные колонны, плотные волокна, продольные столбы и соединяющие их ребра, а также внешняя волокнистая оболочка образуют каркас хвостика. В дистальном отделе количество микротрубочек сильно редуцируется. Снаружи хвостик покрыт цитолеммой.
1.2. Яйцеклетка – женская половая клетка с гаплоидным набором хромосом. При электронномикроскопическом исследовании в цитоплазме яйцеклетки выделяются митохондрии, комплекс Гольджи, хорошо развитые гранулярную и агранулярную эндоплазматическую сеть. Снаружи яйцеклетка окружена плазматической мембраной - цитолеммой, под которой располагается толстый слой цитоплазмы (кортикальный слой), содержащий кортикальные гранулы (рис. 1.2). Кортикальной слой играет важную роль в организации яйцеклетки, а также в оплодотворении.
Рис. 1.2. Электронная микрофотография овариального яйца крысы; в кортикальном слое видны кортикальные гранулы (1), микроворсинки яйца (2) и отростки (3) фолликулярных клеток (4), проникающие через zona pellucida
Яйцеклетки имеют хорошо развитый и своеобразно организованный цитоскелет. Его компоненты связаны с цитолеммой и вызывают постоянную модификацию поверхности клетки, в которой могут появляться и исчезать микроворсинки, меняться локализация рецепторов. Яйцеклетки окружены блестящей оболочкой и слоем фолликулярных клеток. Между блестящей зоной и цитолеммой овоцита имеется небольшое перивителлиновое пространство, которое существенно увеличивается после оплодотворения, поскольку в него выделяются содержимое кортикальных гранул. Фолликулярные клетки через отверстия в блестящей оболочке посылают к цитолемме овоцита свои отростки.
В цитоплазме яйцеклетки содержатся запасные питательные вещества: жир, гликоген, желток. Желток представляет собой совокупность химических веществ (белков, жиров, углеводов) для снабжения развивающегося зародыша питательными веществами. Количество желтка в яйцеклетках сильно варьирует в разных группах животных. У амфибий, рептилий, птиц компоненты желтка синтезируются в печени, с током крови поступают в яичник, проходят через фолликулярный эпителий и поступают в овоцит путем микропиноцитоза.
В ряду позвоночных в зависимости от наличия желтка, его количества и распределения по ооплазме различают алицетальные (без желтка) и лецитальные (с желтком) яйцеклетки (рис. 1.3).
Рис. 1.3. Основные типы яйцеклеток, различающиеся между собой по количеству и характеру распределения гранул желтка:
А – олиголецитальная, первично изолецитальная яйцеклетка (ланцетник); Б – полилецитальная, умеренно телолецитальная яйцеклетка (амфибии); В – полилецитальная, резко телолицетальная яйцеклетка (птицы); Г – олиголецитальная, вторично изолецитальная яйцеклетка (млекопитающие).
Лецитальные клетки делятся на олиголецитальные (маложелтковые) и полилецитальные (многожелтковые).
В зависимости от распределения желтка по ооплазме яйцеклетки делятся на изолецитальные, умеренно телолецитальные и резко телолецитальные.
В изолецитальных яйцеклетках желток распределен равномерно. В умеренно телолецитальных яйцеклетках желток находится на одном полюсе, который называется вегетативным. На другом полюсе - анимальном - лежат органеллы и ядро. В резко телолгцитальных клетках вегетативный полюс выражен особенно сильно и занимает большую часть клетки.
Яйцеклетки млекопитающих, в том числе и человека, являются олигоизолецитальными: содержат очень мало желтка, который равномерно распределен по ооплазме.
Кроме желтка цитоплазма яйцеклетки содержит морфогенетические факторы – молекулы, направляющие дифференцировку клеток для образования различных тканей и органов, которые рассеяны по всей яйцеклетке и распределяются между разными бластомерами при дроблении.
2. Прогенез (гаметогенез) – процесс формирования гамет. Гаметогенез делится на сперматогенез (образование сперматозоидов) и овогенез (образование яйцеклеток).
2.1. Сперматогенез – процесс формирования и развития мужских половых клеток - сперматозоидов. В сперматогенезе различают 4 фазы: размножение, рост, созревание и формирование.
На протяжении периода размножения мужские половые клетки представлены сперматогониями. Это мелкие округлые клетки, делящиеся путем митоза. Они подразделяются на темные и светлые сперматогонии. Темные сперматогонии являются истинными стволовыми клетками, устойчивы к действию вредных факторов и редко делятся. Светлые сперматогонии разделяются на А и В-сперматогонии. А-сперматогонии являются полустволовыми клетками, способными к частым митотическим делениям. При делении каждой такой клетки могут возникать либо две А-сперматогонии, либо одна А- и одна В-сперматогония. В-сперматогонии также способны делиться митозом, но при этом не происходит полной цитотомии, и клетки оказываются связанными между собой цитоплазматическими мостиками. Возникают клоны (ассоциации) клеток.
После некоторой паузы В-сперматогонии вступают в период роста, в течение которого превращаются в сперматоциты I порядка. Для периода роста характерно увеличение ядра и цитоплазмы развивающихся клеток, их размеры увеличиваются в четыре и более раз.
Диплоидные сперматоциты I порядка не делятся митозом, но вступают в период созревания, который состоит из двух последовательных делений мейоза (мейоз I и мейоз II). Гаплоидные сперматоциты II порядка образуются в результате I деления мейоза.
Мейоз I (редукционное деление) – в ходе его происходит уменьшение в два раза количества хромосом с формированием гаплоидного генома. Мейоз I имеет сложную профазу, состоящую из 5 стадий: лептотены, зиготены, пахитены, диилотены и диакинеза. На стадии лептотены хромосомы спирализуются и становятся видны в виде длинных тонких нитей. На стадии зиготены гомологичные хромосомы коньюгируют друг с другом. На стадии пахитены хромосомы сильно спирализуются и укорачиваются. В это время в них происходит кроссинговер - обмен генами. Диплотена характеризуется расщеплением хромосом на хроматиды и образованием тетрад. В диакинезе хромосомы еще более утолщаются и несколько отходят друг от друга. Таким образом, в профазе мейоза 1 происходит подготовка к редукции числа хромосом. В метафазе гомологичные пары хромосом располагаются на экваторе клетки. В анафазе к полюсам отходят целые гомологичные хромосомы, т.е. осуществляется редукция генома. В телофазе происходит цитотомия, в результате чего образуются два сперматоцита II порядка с гаплоидным набором хромосом. Их хромосомы состоят из двух хроматид.
Мейоз II (эквационное или уравнительное деление) протекает по типу обычного митоза, но в гаплоидной клетке. В анафазе к полюсам отходят половинки хромосом–хроматиды, а в результате телофазы образуются сперматиды, содержащие хроматиды хромосом. Сперматиды, как и сперматоциты II порядка, содержат гаплоидный набор хромосом. Из I сперматоцита I порядка образуется 4 сперматиды.
Все образующиеся в процессе сперматогенеза клетки (В-сперматогонии, сперматоциты I и II порядка, а также сперматиды) остаются связанными между собой цитоплазматическими мостиками в клеточные ассоциации или клоны. Окончательное разделение клеток происходит в фазу формирования.
Сохранение цитоплазматических мостиков между клетками имеет большой биологический смысл. Оказывается, что для полноценной дифференцировки сперматозоидов необходим весь диплоидный геном и продукты его деятельности. Во-первых, потому, что в исходном диплоидном геноме могут содержаться дефектные, летальные аллели генов, и клетка, получившая их, погибнет, если не будет обеспечена продуктами нормального аллеля, находящегося в ядрах других клеток, его получивших. Во-вторых, как известно, одни мужские половые клетки получают Х-, другие - Y- половую хромосому. Каждая из них содержит много важных генов, необходимых для развития сперматозоидов. Поэтому, благодаря цитоплазматическим мостикам развивающиеся мужские половые клетки получают продукты деятельности всего диплоидного генома.
Фаза формирования является самой продолжительной фазой сперматогенеза. В процессе ее из сперматид образуются сперматозоиды. Часто эту фазу называют спермиогенезом (рис. 1.4).
Процесс спермиогенеза начинается образованием из комплекса Гольджи вначале акробласта, а затем акросомы, которая содержит ферменты для разрушения яйцевых оболочек. Центросома, состоящая из двух центриолей, перемещается на противоположный полюс. Проксимальная центриоль прилежит к ядру, а дистальная делится на две части. Из одной части формируется жгутик, который превращается в осевую нить хвостика. Вторая часть играет роль базального тельца. Образуются элементы цитоскелета: сегментированные колонны, плотные волокна, продольные столбы с ребрами.
Рис. 1.4. А—Ж — последовательные фазы спермиогенеза:
1 — ядро сперматиды; 2 — аппарат Гольджн; 3 — центриоли; 4 — зачаток акросомы; 5 — митохондрии; 6—жгутик; 7— акросома; 8 — проксимальная центриоль; 9 — дистальная центриоль; 10 — ядерное вещество, сосредоточенное в головке сперматозоида; 11-—митохондриальная спираль; 12 —остатки цитоплазмы; 13 — головка; 14 — шейка; 15 — средняя часть; 16 — хвост; 17 — концевой участок хвоста.
Цитоплазма сперматозоида сильно редуцируется, а ядро становится вытянутым, компактным и гипербазофильным. На заключительных этапах формирования сперматозоиды отделяются от соединяющей их друг с другом общей цитоплазмы и становятся свободными. Оставшаяся после отделения цитоплазма (остаточные тельца) подвергается фагоцитозу.
2.2. Овогенез протекает сходно со сперматогенезом, но имеет ряд отличий. Исходными клетками для овогенезя являются первичные половые клетки (гонобласты), развивающиеся в раннем эмбриональном периоде в женской половой железе – яичнике (рис. 1.5). Гонобласты превращаются в овогонии. Эти мелкие клетки вступают в фазу размножения и интенсивно делятся митозом. Затем все они превращаются в овоциты I порядка, которые блокируются на определенной стадии мейоза I.
Далее овоциты I порядка вступают в длительный период роста. Период роста делится на две части: период малого или медленного роста, и период большого или быстрого роста. В период быстрого роста идет подготовка к прохождения мейоза. Третья фаза овогенеза - созревание - начинается перед овуляцией. Происходит первое мейотическое деление и образуется гаплоидный овоцит II порядка, который вступает во второе мейотическое деление, но блокируется в метафазе II.
Рис. 1.5. Схематическое изображение яичника:
1 — мезоварий; 2 —герминативный эпителий; 3 — первичный фолликул; 4 — двуслойный фолликул; 5 — начало образования полости фолликула; 6—атретический фолликул; 7— почти полностью созревший фолликул; 8 — атретический фолликул; 9 — зрелый фолликул; 10 — ооцит; 11 — полость, наполненная фолликулярной жидкостью; 12 — разорвавшийся фолликул; 13 — высвободившаяся яйцеклетка; 14 — развивающееся желтое тело; 15 — соединительная ткань; 16 — лютеиновые клетки; 17 — фибрин крвяного сгустка; 18 – свернувшаясякровь; 19 – соединительная ткань яичника; 20 – полностью сформировавшееся желтое тело; 21 – беловатое тело яичника; 22 – кровеносные сосуды.
Завершение созревания инициируется оплодотворением. В отличие от сперматогенеза, возникающие в ходе овогенеза в результате двух делений мейоза клетки, не равны по размерам. Из овоцита I порядка образуется крупный овоцит II порядка и очень мелкое направительное (редукционное) тельце. Первое редукционное тельце во II делении мейоза также может делиться на два направительных (редукционных) тельца. Следовательно, в результате двух делений мейоза образуется одна гаплоидная яйцеклетка и три гаплоидных направительных (редукционных) тельца, которые вскоре погибают. Таким образом, в процессе гаметогенеза формируются зрелые половые клетки.
Генеративные клетки отличаются от соматических следующими параметрами:
- гаплоидным набором хромосом, а значит, невозможностью обычного размножения и обычного метаболизма;
- резко измененным ядерно-цитоплазматическим отношением (в обычных соматических клетках ЯЦО 1:6- 1:10; у сперматозоида ЯЦО составляет 1;0,2 - 1:0,5; а у яйцеклетки- 1:500)
- нормальный метаболизм клетки может осуществляться только при теснейшем взаимодействии ядра и цитоплазмы: у половых клеток очень необычный обмен веществ, он находится в состоянии депрессии.
- половые клетки - это высокоспециализированные клетки, обладающие многими специальными, выработавшимися в процессе эволюции приспособлениями для выполнения специфических функций: встреча клеток, их соединение, защита зиготы.
- из-за высокой специфичности и необычного обмена веществ эти клетки нуждаются в особых условиях обитания, защитных и питательных структурах (оболочки яйцеклетки).
- женские клетки содержат питательные вещества для развития зародыша, имеют громадный объем цитоплазмы и поэтому неподвижны; мужские клетки в десятки и сотни раз мельче, имеют запас энергии и жгутик для перемещения к женской клетке.