10. Клонирование генов.

Для выделения нужного фрагмента ДНК в препаративных количествах его необходимо встроить в плазмиду - вектор, вскрытую той же рестриктазой, которую использовали для получения рестриктов геномной ДНК. В качестве векторов служат плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам. В настоящее время работают с искусственными рекомбинантными плазмидами, которые несут два или три гена устойчивости, в которых содержат по одному уникальному сайту рестрикции для какой-либо рестриктазы. Это плазмиды pBR322, 324, 325 и др. Например, плазмида pBR322 несет гены устойчивости к ампициллину(Ap) и тетрациклину(Tc). В гене Ap находится уникальный сайт для рестриктазы Pst1, а в гене Tc – для BamH1. Вскрывая вектор pBR322 по сайту BamH1 в гене Tc, в него можно встроить фрагменты, полученные при помощи той же рестриктазы за счет взаимодействия липких концов. Если теперь трансформировать клетки компентентной культуры E.coli плазмидой pBR322 со встроенным в неё фрагментом, то трансформантов можно отобрать на среде с ампициллином. Далее проверяют на устойчивость к тетрациклину. Если трансформацию осуществляла плазмида со вставкой фрагменты в ген Tc, трансформант должен быть чувствителен к тетрациклину, поскольку ген Tc оказался разован и инактивирован вставкой. Далее клонируемый ДНК может быть ограничено размножен в ходе клеточных делений трансформанта. Широко применяют векторы на основе бактериофага лямбда. Известно что средняя часть генома лямбда не существенна для его литического размножения в E.coli и может быт ьзаменена на чужеродный фрагмент ДНК. Образуются после размножения в клетке фаги с чужеродными фрагментами ДНК. В этом случае клонируемый участок ДНК хранят в виде частиц бактериофага или в виде клона бактерии с интегрированными гибридными профагами. Поскольку трансформацию осуществляют смесью плазмид с разными вставками, то различные клетки в результате трансформации получат разные фрагменты клонируемой ДНК. Следовательно, на этом этапе нужно собрать как можно больше клонов трансформантов, чтобы быть уверенными в том, что искомый ген находится в одном из клонов. Так создают банки генов. Объем банка : N =( M/m ) * ln (1-P)

РЕСТРИКТАЦИОННЫЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ.

Исследуя различные штаммы E-coli, Арбер обнаружил, что ДНК этого фага при переходе через бактерию разрезается и теряет свою инфекционность. Оказалось, что ни классические рекомбинационные процессы, ни мутации в этом не участвуют. Более того, такая судьба постигала не только фаговую, но и любую чужеродную ДНК, попадающую в бактерию. Такое разрезание(рестрикцию) следует рассматривать как защитный механизм клетки. Как было показано в дальнейшем, рестриктация чужеродной ДНК осуществляется ферментами, называемыми рестриктационными эндонуклеазами (рестриктазами). Встаёт вопрос, почему рестриктазы не разрезают ДНК собственной клетки? Ответ был найден Арбером и состоял в следующем: эти ферменты вступают в реакцию с определенными участками в ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке защищены метильными группами (метилированы). Правда, первые из открытых эндонуклеаз не были специфическими, а действовали случайным образом. Первой рестриктазой, которая расщепляла ДНК, в строго определенном месте, была Hind, открытая Смитом в конце 60-х годов. Этот фермент впервые использован Натсоном и соавторами для создания рестриктационнй карты генома вируса SO40. Берг уловил особое свойство двухцепочной ДНК формировать при обработке рестриктазами так называемые «липкие концы». После разрезания одна из цепей оказывается длиннее, чем другая, на несколько нуклеотидов. Эти нуклеотиды могут свободно спариваться с другими, например с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента ДНК с «липкими концами». Благодаря этому, ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы.

11. Хромосомная теория наследственности.

1) Гены находятся в хромосомах;

2) В хромосомах гены располагаются линейно;

3)Мерой расстояния между генами является частота рекомбинантных обменов (кроссинговера). Частота кроссинговера – доля рекомбинантных особей к общему числу потомков, полученных в результате анализирующего скрещивания;

4) За единицу рекомбинации принят 1% или 1 сМ. Частоту кроссинговера одного гена рассчитывают между ним и центромерой.

Основные доказательства хромосомной теории наследственности были получены в экспериментах Т.Х. Моргана и его сотрудников в начале нашего столетия (опыты на дрозофилах).

Принцип линейности: гены в хромосомах располагаются в линейку.

Принцип аддитивности: отрезок произвольной длины может быть представлен в виде суммы отрезков, его составляющих. Использовался Морганом для построения карт.

Группа сцепления: группа генов, проявляющих сцепленное наследование.

12. Методы изучения структуры и функции гена.