47. Внутригенное картирование.

Генетическое картирование - это определение группы сцепления и положения картируемого гена относительно других генов данной хромосомы. Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты этой процедуры. Как правило, число генов в группах сцепления зависит от линейных размеров соответствующих хромосом. Однако, протяженные области конститутивного гетерохроматина (в районе центромеры и теломерных участков) практически не содержат генов и, таким образом, нарушают эту зависимость.

На первом этапе картирования определяют принадлежность гена к той или иной группе сцепления. Как известно, у D. melanogaster вдиплоидном наборе четыре пары хромосом: первая пара — половые хромосомы (XX — у самок, XY — у самцов), вторая, третья и четвертая — аутосомы. Число генов в Y-хромосоме самцов очень мало. Для локализации вновь возникшей мутации необходимо располагать набором маркерных генов для каждой хромосомы. Картирование мутации основывается на анализе ее сцепления с этими маркерами. Например, если интересующая нас мутация наследуется независимо от маркеров второй хромосомы, делается вывод о ее принадлежности к другой группе сцепления.

Скрещивания проводятся до тех пор, пока не удастся выявить сцепленное наследование анализируемой мутации с маркерными мутациями какой-либо хромосомы.

Второй этап картирования подразумевает определение положения гена на хромосоме. Для этого подсчитывают расстояние между этим геном и уже известными, маркерными генами. Для подсчета генетических расстояний проводят специальные скрещивания, в потомстве которых учитывают частоты кроссоверных и некроссоверных особей. Предполагается, что расстояние между двумя генами пропорционально частоте кроссинговера между ними. Следует иметь в виду, что, чем дальше расположены друг от друга гены, тем чаще между ними происходят множественные перекресты и тем больше искажается истинное расстояние между этими генами.

Частая рекомбинация между расположенными далеко друг от друга генами может привести к увеличению числа кроссоверных организмов в потомстве анализирующего скрещивания до 50%, имитируя независимое наследование изучаемых признаков. Поэтому при составлении карт расстояния между далеко расположенными генами следует использовать не непосредственный подсчет числа кроссоверных особей в анализирующих скрещиваниях, а сложение расстояний между многими близко расположенными друг от друга генами, находящимися внутри изучаемого протяженного участка. В этом случае сцепление между далеко расположенными генами можно установить по их сцепленному наследованию с промежуточно-расположенными генами, которые в свою очередь сцеплены между собой. В результате такого метода определения расстояний между генами длины карт хромосом могут превышать 50 морганид.

48. Клонирование нуклеотидных последовательностей.

Клонирование заключается в выделении фрагментов ДНК, встраивании их в нуклеиновую кислоту из другого организма (так называемый вектор), что позволяет получить множество копий каждого фрагмента. В вектор можно встроить фрагмент ДНК размером от десятков до сотен тысяч нуклеотидов. Методы клонирования ДНК описаны в работе Watson J.D. et al., 1992. (см." Генетика и болезни: литература " ).

С помощью обратной транскриптазы на матрице мРНК можно синтезировать кДНК , пригодную для клонирования и анализа. Клоны кДНК (в отличие от клонов геномной ДНК) не содержат последовательностей, соответствующих интронам . Клоны геномной ДНК и кДНК выделены для сотен генов и для тысяч их фрагментов, а также для так называемых анонимных областей генома человека . Выполняющие неизвестную функцию анонимные области - это уникальные участки генома, часто содержащие полиморфные генетические маркеры. На основании полного или частичного определения нуклеотидной последовательности клонированной кДНК определяют аминокислотную последовательность белка и сравнивают с аминокислотными последовательностями известных белков.

В любой клонированный фрагмент можно ввести метку (радиоактивный изотоп, биотин и др.) и использовать его как специфический молекулярный зонд . Радиоактивные зонды выявляют с помощью радиоавтографии, а биотинилированные - с помощью меченого авидина.

Клонирование позволило получить зонды для анализа ДНК, для выявления мутаций, вызывающих заболевания, а также установить последовательность нуклеотидов в ДНК, зная которую можно определить аминокислотную последовательность в белке и приготовить праймеры для амплификации ДНК с помощью ПЦР .