33.Методы изолирования ядовитых веществ подкисленным спиртом и подкисленной водой (а.В. Васильевой, Стаса-Отто). Их особенности, преимущества, недостатки, техника проведения.
Метод Васильевой. 50-100,0 биоматериала измельчают и заливают водой, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой и настаивают при комнатной температуре в течение 1 часа, перемешивают, проверяют значение рН, вытяжку фильтруют, центрифугируют и экстрагируют хлороформом (трижды) – осторожно, во избежание эмульгирования с водой. Водную фазу подщелачивают 20% NaOH и трижды экстрагируют хлороформом.
Достоинства:
1. Быстро (в течение 1 рабочего дня).
2. Дешево.
3. Почти отсутствуют потери ТВ из-за многократной очистки вытяжки.
Недостатки:
1. Вода является не универсальным растворителем. Извлечение содержит большое количество балластных веществ, возможно образование эмульсии на этапе экстракции. Нельзя использовать с несвежим биоматериалом.
Метод Стаса-Отто 50,0-100,0 биоматериала измельчают и заливают абсолютным этанолом, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой до рН=2-3. Перемешиваем и проверяем значение рН, настаиваем при комнатной температуре в течение суток при периодическом перемешивании и проверяем значение рН. Жидкую фазу сливаем, операцию повторяем 2-3 раза (в течение 2-3 суток), затем биоматериал помещаем на фильтр и промываем спиртом; спиртовые вытяжки объединяют и упаривают на водяной бане при 40-50°С до густоты сиропа. Сиропообразную жидкость обрабатывают этанолом до прекращения выпадения осадка, жидкость фильтруют, снова упаривают до густоты сиропа и вновь осаждают белки. Остаток обрабатывают 20-25 мл воды, осадок отфильтровывают, проводят экстракцию хлороформа (203 порции), получают кислое хлороформное извлечение. Водную фазу подщелачивают 25% раствором NH4OH до рН=9-10, извлекают хлороформом (2-3) порции, получают щелочное хлороформное извлечение.
1. Для подкисления используют органические кислоты для избежания гидролиза сложноэфирных, амидных и других связей.
2. Для подщелачивания берут только NH4OH т.к. при использовании NaOH будут образовываться феноляты, ХР в воде.
Достоинства метода:
1. Данный метод является общим, им можно извлечь большую группу ТВ.
2. Извлечение получается чистым, можно работать с несвежим биоматериалом.
3. Этанол является универсальным растворителем и извлекает большое количество ТВ.
Недостатки:
1. Метод чрезвычайно длительный (7-10 рабочих дней).
2. Большое количество осаждений молекул приводит к потере ТВ.
3. Этанол является дорогостоящими растворителем.
34.Основы метода изолирования токсикантов водой, подкисленной кислотой? Влияние на степень извлечения веществ измельчённости объекта, рН среды, экстрагента и природы кислоты. Последовательность проведения изолирования. Схема метода.
Изолирование водой, подкисленной щавелевой кислотойСхема изолирования по методу Васильевой заключается в следующем:
Настаивание измельчённого объекта с водой, подкисленной щавелевой кислотой до рН = 2 – 3, в течение двух часов. Вода берётся в количестве 1 : 2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется. • Экстрагирование веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера из водного фильтрата хлороформом при рН = 2 (трёхкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием (фракция А, «кислое» извлечение). Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя раствором аммиака до рН 9 – 10, экстрагирование веществ основного характера трёхкратной экстракцией хлороформом, отделение органической фазы и концентрирование упариванием (фракция Б, «щелочное» извлечение). По сравнению с изолированием подкисленным спиртом извлечение водой, подкисленной щавелевой кислотой, обладает рядом преимуществ: 1. Быстрота (анализ можно провести в течение одного рабочего дня). 2. Меньшее количество операций, меньшие потери искомых веществ (алкалоиды извлекаются на 30 – 40 %).3. Экономичность и дешевизна, т.к. дорогой спирт заменён водой. Недостатком метода является образование стойких эмульсий при экстрагировании веществ из водной фазы хлороформом, особенно при исследовании гнилостного биоматериала, т.к. метод не предусматривает очистки извлечений
Частные методы изолирования :
- изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод американского ученого Валова)
- изолирование алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко)
- другие методы для отдельных групп веществ
Изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод Валова) схематично можно представить следующим образом:
Настаивание измельченного объекта с водой, подщелоченной 20% раствором гидроксида натрия до рН 10 и более, в течение 30 минут.
Очистка водного извлечения путем насыщения вольфраматом натрия в кислой среде (Н2SO4 до рН 2), фильтрование раствора.
Экстрагирование эфиром, концентрирование эфирного извлечения упариванием.
Выход составляет 50% и даже до 90% в зависимости от вида барбитурата. Метод дает достаточно чистые извлечения, т.к. включает стадию очистки (осаждение белков вольфраматом натрия), что повышает качество последующего анализа.
Изолирование
барбитуратов из биологического материала
частным методом (метод Валова) проводится
по следующей схеме:
Недостатком метода является соосаждение барбитуратов с белками при обработке вольфраматом натрия. В последней модификации метода Н2SO4 заменена NaHSO4, что увеличивает выход искомых веществ.
Частный метод изолирования алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко)
Схема метода состоит из следующих этапов:
Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной 20% раствором серной кислоты до рН2-3, в течение двух часов. Вода берется в количестве 1:2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется. Операция повторяется двукратно.
Очистка водного извлечения от белковых соединений путем насыщения его сульфатом аммония, настаивания в течение часа и фильтрования образовавшегося осадка.
Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов путем экстракции эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают.
Подщелачивание водного извлечения 20% раствором гидроксида натрия и экстрагирование веществ основного характера хлороформом при рН=9-10 (трехкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием.
Изолирование
алкалоидов из биологического материала
частным методом (метод Крамаренко)
проводится по следующей схеме:
Влияние различных факторов на экстракцию:
На экстракцию веществ органическими растворителями оказывают влияние различные факторы: природа экстрагируемого вещества, природа экстрагента, число экстракций, объем экстрагента, температура, рН среды, присутствие электролитов в водных растворах, скорость взбалтывания и др.). Число экстракций и объем экстрагента. Чем больше число экстракций, тем выше степень извлечения экстрагируемого вещества. Чем больше объем органической фазы экстрагента, т.е. чем выше отношение Vорг./Vводн., тем больше степень извлечения экстрагируемого вещества. Влияние рН среды на экстракцию. С повышением рН (т.е. с уменьшением концентрации водородных ионов в водном растворе) увеличивается диссоциация кислоты в растворе, что приводит к уменьшению ее недиссоциированных молекул. В результате понижается экстрагируемость слабой кислоты органическими растворителями. Влияние температуры на экстракцию. Изменение температуры влияет на константу распределения экстрагируемого вещества. Это объясняется тем, что при изменении температуры изменяется растворимость экстрагируемых веществ в каждой фазе, а также изменяется взаимная растворимость органической и водной фаз. Причем с изменением температуры растворимость вещества в каждой фазе изменяется неодинаково. При изменении температуры может изменяться диссоциация и ассоциация вещества в соответствующей фазе. Поэтом у при изменении температуры изменяется гидратация (сольватация) и экстрагируемость химических соединений.