15. Ингибирование ферментов. Виды ингибирования, примеры. Лекарственные вещества как ингибиторы ферментов.

Действие фермента можно подавить или частично, или полностью, т.е. ингибировать определёнными химическими веществами, находящимися в организме или поступающими извне. Эти вещества называются ингибиторами.

Ингибирование - снижение каталитической активности в присутствии определенных веществ – ингибиторов.

Виды ингибирования: • по обратимости (обратимое, необратимое); • по механизму (конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное, частным случаем которого является субстратное); • по специфичности (специфическое, неспецифическое).

Обратимое - ингибитор нековалентно взаимодействует с ферментом, при этом образуется комплекс, способный к диссоциации. Удаление ингибитора восстанавливает активность фермента.

Необратимое – некоторые соединения могут специфически связывать определенные функциональные группы активного центра фермента. Они образуют с ним прочные ковалентные связи, поэтому такой комплекс трудно разрушить. Для восстановления активности фермента требуются специальные реактиваторы.

Необратимое ингибирование: образуются стабильные ковалентные связи между субстратом и ингибитором; ионы ртути – необратимые ингибиторы.

Конкурентное ингибирование: • ингибитор – структурный аналог субстрата; • возникает конкуренция молекул ингибитора и субстрата за связывание с активным центром фермента; • ингибирование зависит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора; • при формировании комплекса фермент-ингибитор продукта реакции не образуется; • ингибирование обратимое (увеличение концентрации субстрата вытесняет ингибитор).

фумарат

сукцинат

Пример конкурентного ингибирования сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой:

сукцинатдегидрогеназа

сульфаниламид

Конкурентным ингибитором данной реакции является малоновая кислота, поэтому с активным центром фермента связывается и та, и другая кислота, в зависимости от их соотношения в растворе. Чтобы снять частично или полностью действие конкурентного ингибитора, нужно повысить концентрацию субстрата. При этом весь фермент будет находиться в форме фермент-субстратного комплекса, а доля комплекса фермент-ингибитор будет резко понижаться, поэтому скорость ферментативной реакции может быть максимальной даже в присутствии ингибитора. Многие лекарственные препараты действуют по типу конкурентного ингибитора. При этом они тормозят активность ряда ферментов, необходимых для функционирования бактериальных клеток. Примером является применение сульфаниламидов (СА). При различных инфекционных заболеваниях, которые вызываются бактериями, применяются СА препараты. Эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которая используется бактериями для синтеза фолиевой кислоты, необходимой для роста и размножения бактерий.

Введение СА приводит к ингибированию ферментов бактерий, которые синтезируют фолиевую кислоту. Нарушение синтеза этой кислоты проводит к нарушению роста микроорганизмов и их гибели. По принципу конкурентных ингибиторов действует целая группа различных препаратов - это обратимые ингибиторы холинэстеразы (прозерин, физостигмин), катализирующей гидролиз ацетилхолина. Ацетилхолин обеспечивает проведение нервного импульса.

Антихолинэстеразы конкурируют с ацетилхолином за активный центр фермента холинэстеразы. В результате этого распад ацетилхолина тормозится, он накапливается в организме, вызывая нарушение проведения нервного импульса, перевозбуждение парасимпатической НС. Соединение прозерина с холинэстеразой сравнительно непрочно и в течение 2-4 ч подвергается спонтанному гидролизу, что приводит к восстановлению активности фермента.

Неконкурентное ингибирование: • ингибитор не является структурным аналогом субстрата; • ингибитор связывается с ферментом вне активного центра; • ингибитор может связываться с фермент-субстратным комплексом, образуя тройной неактивный комплекс (соли тяжелых металлов, цианиды); • повышение концентрации субстрата на скорость реакции не влияет; • ингибитор модифицирует функциональные группы фермента; • ингибитор не влияет непосредственно на связывание фермента с субстратом, но изменяет конформацию фермента и активного центра; • действие ингибитора можно снять только с помощью специальных веществ – реактиваторов.

В качестве неконкурентного ингибитора выступают цианиды. Они прочно связываются с ионами железа, которые входят в состав каталитического геминового фермента - цитохромоксидазы. Этот фермент является одним из компонентов дыхательной цепи. Блокирование дыхательной цепи выключает её из работы, что приводит к мгновенной гибели организма. Примером неконкурентного ингибитора также являются соли тяжёлых металлов. Некоторые ферменты полностью ингибируются очень малыми концентрациями ионов тяжелых металлов, например ионов ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As+), или йодуксусной кислотой. Эти вещества необратимо соединяются с сульфгидрильными группами (-SH) и вызывают осаждение ферментного белка. При этом образуется F-S-I комплекс. Фермент способен присоединять субстрат, но дальнейшего превращения субстрата не происходит, т.к. функциональные группы фермента заблокированы. Реакция непродуктивна. Снять действие неконкурентного ингибитора очень сложно, т.к. ионы металлов очень прочно связываются с функциональными группами фермента.

Существует также понятие "суицидных субстратов". Речь идет о субстратных аналогах, содержащих дополнительно реакционную группу. Т.е. они чем-то похожи по строению на субстрат, но вызывают модификацию функциональных групп фермента. Вначале они связываются обратимо, а затем образуют ковалентное соединение с активным центром фермента. Поэтому ингибирование такими соединениями проявляется как неконкурентное. Известным примером такого ингибитора являются фосфорорганические соединения БОВ (зарин, заман, метилфторфосфорилхолин), инсектициды (хлорофос, карбофос, дихлофос).

Ингибирование холинэстеразы «суицидным субстратом» фосфорорганическим соединением.

Бесконкурентное ингибирование. Снижение скорости ферментативной реакции становится возможным после образования комплекса ES. Ингибитор не может связаться со свободным ферментом. Субстрат, образуя комплекс с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор, в свою очередь, меняет конформацию активного центра фермента, и превращение субстрата не происходит.

Ингибирование субстратом (субстратное ингибирование) – частный случай бесконкурентного ингибирования. Активность ферментов тормозится избытком субстрата. При этом образуется комплекс ES, но субстрат не подвергается превращениям, так как комплекс непродуктивный. Существует несколько механизмов субстратного ингибирования: • одновременное присоединение к активному центру двух или более субстратов; • присоединение не только к активному центру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным с активным центром; • при избытке субстрата может повыситься ионная сила реакционной среды и, как следствие, затормозиться скорость ферментативной реакции.

Действие субстратного ингибитора снимается путем уменьшения концентрации субстрата.

Специфические ингибиторы – вступают в реакции с определенными группами отдельных веществ (Диизопропилфторфосфат (ДФФ) связывается ОН-группами серина).

Неспецифические ингибиторы – связываются с функциональными группами различных веществ (ацетат йода неспецифически связывается с SH-группами).

Неспецифическое ингибирование фермента ацетатом йода: