2.4 Определение бактерицидной активности чашечным методом

Суть метода заключается в экспозиции анализируемых бактерий на тестируемой бактерицидной поверхности, с целью подсчета оставшихся жизнеспособных клеток бактерий и их сравнение с контролем.

Метод осуществлялся в соответствии с JIS Z 2801 «Антимикробные тест-средства на антимикробную активность и эффективность», и был изменен для анализа бактерицидной активности покрытий нестихиометрического состава [8].

Бактерией, используемой для теста, является Escherichia coli.

1. Методы стерилизации

2.4.1.1 Стерилизация сухим жаром

Поместите объект, который будет стерилизоваться в сушильный шкаф, нагретый до температуры от 160 °C до 180 °C, и грейте его в течение 30- 60 минут.

2.4.1.2 Стерилизация паром высокого давления

Вода и объекты, которые будут стерилизоваться, помещаются в автоклав. Закрутите крышку на автоклаве, нагрейте его и держите его при температуре 121 °C и давлении на 103 кПа в течение 15-20 минут. Прекратите нагревать его, охладите его, чтобы понизилась температура до 100 °C и откройте выпускной клапан, чтобы снять пар. После этого выньте стерилизованные объекты, и, если необходимо, охладите их в ламинар боксе. Чтобы содержать автоклав, вымойте его с нейтральным моющим средством или в случае необходимости достаточно ополоснуть его водой.

2.4.1.3 Стерилизация в пламени

Помещайте объекты, которые будут стерилизоваться в пламя газа или алкоголя. Для платиновой петли и для пробирки достаточно коснуться пламени в течении 2-3 сек.

2.4.1.4 Подготовка посуды

Стеклянная посуда, такая как пробирки моются щелочью или нейтральным моющим средством, их достаточно ополоснуть водой, высушить и использовать или после стерилизации сухим жаром, или после стерилизации паром высокого давления.

2. Приготовление сред и растворов

1. Приготовление питательного бульона

Берем 3,0 г говяжьего экстракта, 10,0 г пептона и 5,0 г поваренной соли на 1000 мл очищенной или деминерализованной воды. Помещайте их в колбу, смешайте их, растворите их полностью и отрегулируйте pH от 7,0 до 7,2 (25 °C) используя раствор гидроокиси натрия или раствор соляной кислоты. Когда среда будет использоваться, разделите на части в пробирки, вставьте ватную пробку и стерилизуйте ее с паром высокого давления. Если она сразу не используется после подготовки, то сохраните ее в температуре от 5 °C до 10 °C. Никогда не используйте питательный бульон, который сохранялся в течение одного месяца или дольше после подготовки.

2. Приготовление питательного агара

Берем 5,0 г говяжьего экстракта, 10,0 г пептона, 5,0 г поваренной соли и 15,0 г агарового порошка на 1000 мл очищенной или деминерализованной воды. Поместите их в колбу, смешайте их и поместите в теплую водяную баню до растворения. Отрегулируйте pH от 7,0 до 7,2 (25 °C) используя раствор гидроокиси натрия или раствор соляной кислоты, вставьте ватную пробку и стерилизуйте ее паром высокого давления. Если среда не используется после подготовки, то сохраните ее в температуре от 5 °C до 10 °C. Никогда не используйте питательный агар, который сохранялся в течение одного месяца или дольше после подготовки.

3. Приготовление агара для определения количества бактерий посевом

Берем 2,5 г дрожжевого экстракта, 5,0 г триптона, 1,0 г глюкозы и 15,0 г агарового порошка в 1000 мл очищенной водной или деминерализованной воды. Помещайте их в колбу, смешайте их и поместите в теплую водяную баню до растворения. Отрегулируйте pH от 7,0 до 7,2 (25 °C) используя раствора для гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты, вставьте ватную пробку и стерилизуйте ее с паром высокого давления. Если она сразу не используется после подготовки, то сохраните ее в температуре от 5 °C до 10 °C. Никогда не используйте агар для определения количества бактерий посевом, который сохранялся в течение одного месяца или дольше после подготовки.

4. Приготовление бульона SCDLP

Берем 17,0 г казеинового пептона, 3,0 г соевого пептона, 5,0 г поваренной соли, 2,5 г вторичного кислого фосфорнокислого натрия, 2,5 г глюкозы и 1,0 г лецитина и растворяйте в 1000 мл очищенной или деминерализованной воды. Поместите раствор в колбу, смешайте и добавьте 7,0 г неионогенного поверхностно-активного вещества, растворив их. Отрегулируйте pH до 6,8-7,2 (25 °C) используя раствор гидроокиси натрия или раствор соляной кислоты. Перед использованием среды, распределите ее по пробиркам или колбам Эрленмейера, вставьте ватные пробки и стерилизуйте паром высокого давления. Если она сразу не используется после подготовки, то сохраните ее в температуре от 5 °C до 10 °C. Никогда не используйте бульон SCDLP, который хранился в течение одного месяца или дольше после подготовки.

4. Приготовление буферного раствора фосфата

Внесите 34,0 г первичного кислого фосфорнокислого калия в мерную колбу, затем добавьте и смешайте 500 мл очищенной или деминерализованной воды, чтобы растворить содержимое. Отрегулируйте pH до 6,8-7,2 (25 °C) используя раствор гидроокиси натрия. Далее, добавьте очищенную или деминерализованную воду, чтобы сделать 1000 мл. Перед использованием раствора, распределите его по пробиркам или колбам Эрленмейера, вставьте ватные пробки и стерилизуйте паром высокого давления. Никогда не используйте буферный раствор фосфата, который хранился в течение одного месяца или дольше после подготовки.

5. Приготовление физиологического раствора с буфером фосфата

Растворите буферный раствор фосфата в физиологическом растворе (раствор поваренной соли на 0,85 %) в 800-кратный объеме. Перед использованием раствора, распределите его по пробиркам или колбам Эрленмейера, вставьте ватные пробки и стерилизуйте паром высокого давления. Если он сразу не используется после приготовления, то сохраните его в температуре от 5 °C до 10 °C. Никогда не используйте физиологический раствор с буфером фосфата, который хранился в течение одного месяца или дольше после подготовки.

6. Приготовление скошенной питательной среды

Вылейте от 6 мл до 10 мл питательного агара, который был нагрет, чтобы раствориться в пробирке. Вставьте ватную пробку и стерилизуйте ее с паром высокого давления. После стерилизации, разместите пробирку в ламинар боксе с уклоном приблизительно 15 ° к горизонтальной плоскости, и подождите пока агар окрепнет. Если среда не используется сразу после подготовки, то сохраните ее в температуре от 5 °C до 10 °C. Никогда не используйте скошенную питательную среду, которая сохранялась в течение одного месяца или дольше после подготовки.