Определение групп крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам (простой метод)

В повседневной клинической практике наиболее часто применяется определение групп крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам. Суть метода-с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток определяется наличие в исследуемой крови групповых антигенов А и В.

Материальное оснащение: стандартные сыворотки 0(I), А(II), В(III), АВ(IV) групп двух серий, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник. Для определения группы крови используют блюдцеобразные пластины (тарелки) с лунками, над которыми имеются обозначения соответственно стандартным сывороткам.

Методика выполнения:

Определение группы крови производится при температуре не ниже +15⁰ С и не выше +25⁰ С.

1. Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

2. Осмотреть стандартные гемагглютинирующие сыворотки, чтобы они не содержали осадка, не был просрочен срок годности, были правильно расположены по отношению друг к другу.

3. На пластинке (тарелке) написать фамилию больного.

4. Согласно обозначениям групп крови на тарелке, в каждую лунку нанести отдельной пипеткой по одной капле стандартной сыворотки - первой, второй и третьей группы двух серий образуя два ряда по три капли в каждом.

5. Взять кровь. Кровь для исследования берется из пальца или вены. При взятии крови из пальца в левую руку взять левую кисть больного, обработать спиртом дистальную фалангу IV пальца и проколоть стерильной иглой, при этом первую каплю крови удалить.

6. Шесть капель крови перенести стеклянной палочкой на терелку, размещая их рядом с каплей стандартной сыворотки. Можно на тарелку нанести одну большую каплю крови, а затем уголком предметного стекла перенести в капли сыворотки. Каждый раз кровь берут новым уголком стекла. Соотношение исследуемой крови и стандартной сыворотки должно быть 1:10.

7. Место укола пальца обработать спиртом.

8. Каждую каплю крови и сыворотки на пластинке смешать отдельной палочкой.

9. Пластинку осторожно покачивать в течение 5 минут, постоянно обращая внимание на лунки, где может наступить аггютинация (склеивание эритроцитов). По мере наступления агглютинации, но не раньше чем через три минуты в капли на пластинке (тарелке) добавить по одной капле изотонического раствора хлорида натрия.

10. Реакция агглютинации может быть положительной или отрицательной.

Агглютинация наступает обычно в течение первых 10-30 секунд. Визуально в капле появляются мелкие красные зернышки (агглютинаты), которые состоят из эритроцитов. Мелкие агглютинаты сливаются в более крупные. Сыворотка обычно частично обесцвечивается. Если агглютинация не происходит сыворотка остается окрашенной в красный цвет, агглютинатов в ней нет. Следует помнить, что кровь содержащая агглютиноген А₂ дает позднюю агглютинацию (на 3-4 минуте).

Результаты исследования в одной и той же группе двух серий должны совпадать.

Способы определения Rh₀(D) в клинической практике

В клинических условиях (в приёмном покое, хирургическом отделении, операционной), где нет специального лабораторного оборудования, используют экспресс-методы определения Rh_o(D) (D-фактора).

Экспресс-метод определения стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования можно использовать свежую несвернувшуюся кровь, взятую из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции. Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), разведённую 33% раствором декстрана (ср. мол. масса 50 000-70 000). Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круго- вым вращением пробирки содержимое размазывают по её внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического

раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов. Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Лабораторные способы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом ра- створе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 ?С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh⁺⁾ осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh^-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод агглютинации в присутствии желатина

B две пробирки помещают по 0,02-0,03 мл осадка исследуемых эритроцитов. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) анти-резусной сыворотки, во вторую (контрольную) пробирку - 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое осторожно перемешивают. Затем пробирки инкубируют в термостате при температуре 45-48 ?С в течение 30 мин, после чего добавляют 5-8 мл физиологического раствора и переворачивают пробирки 1-2 раза для перемешивания.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невоору- жённым глазом или через лупу. Eсли эритроциты резус-положи- тельны, произойдёт их агглютинация. Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что испытуемая кровь резус-отрицательная. B контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

Непрямой антиглобулиновыи тест (реакция Кумбса)

Эта реакция наиболее чувствительна для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-при- надлежности крови, связанных с нечёткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки.

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание, сенсибилизация по отношению к антиглобулиновой сыворотке, которая агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 ?С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации - показатель того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, то испытуемая кровь резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-монокло- нальных антител и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови.

За реакцией наблюдают в течение 3 мин. При смешивании анти- D-MKA с образцами резус-положительных эритроцитов отмечают быстро наступающую лепестковую агглютинацию. Если кровь резусотрицательная, агглютинация отсутствует.

6. Осложнения при переливаниях крови. Профилактика. Лечение.