Розрахунок вмісту компонентів для приготування 136 л середовища

Компонент поживного середовища	Концентрація, г/л	Вміст компонента у 136 л середовища, г	Композиція	Об’єм композиції, л
Меляса	12,0	1644»1700	І	16
дигідрофосфат калію КН2РО4	2,0	274	ІІ	120
діамонійфосфат (NH4)2HPO4	2,6	356
сульфат заліза FeSO4	0,015	2

ДР 2.5.1. Приготування і стерилізація композиції І. 1,7 кг меляси через об'ємно-ваговий дозатор завантажують у збірник об'ємом 25 л. Відкривають вентиль подачі води питної і подають у збірник 16,0 л води. Вмикають мішалку і проводять перемішування протягом 10±1 хвилин. Після цього починають процес стерилізації подачею гострої пари через нижній спуск апарату. Після досягнення тиску усередині апарату 0,05 МПа за показниками манометра (КТ 2.5.1.) починають відлік часу стерилізації. Процес стерилізації триває 30 хв при температурі 112 °С. У рубашку апарату для зменшення енерговтрат подається глуха пара.

ДР 2.5.2. Приготування композиції ІІ.

На технічних вагах зважують сольові компоненти композиції ІІ згідно табл. 2.3 та вручну, через люк, завантажують у збірник об'ємом 200 л. Відкривають вентиль подачі води водопровідної і подають в апарат 120 л водопровідної води. Вмикають мішалку і проводять перемішування проводять упродовж 10±1 хвилин. У рубашку апарату для інтенсифікації процесу розчинення подається глуха пара. Контроль розчинення проводять візуально (КТ 2.5.2.). Для запобігання утворення нерозчинної солі гідрофосфату заліза під час стерилізації, значення рН композиції доводять до 4,5-5,0 додаванням 0,1 н розчину хлоридної кислоти від ДР 1.2. Контроль рН здійснюють за допомогою датчика рН (КТ 2.5.2.).

ДР 2.5.3. Стерилізація композиції ІІ. У попередньо простерилізований посівний апарат об'ємом 250 л за допомогою насосу перекачують композицію ІІ від ДР 2.5.2 та починають процес стерилізації. У апарат подається гостра пара. Після досягнення тиску усередині апарату 0,15 МПа за показниками манометра (КТ 2.5.3) починають відлік часу стерилізації. Процес стерилізації триває 60 хв при температурі 131 °С. У рубашку апарату для зменшення енерговтрат подається глуха пара.

ДР 2.6. Приготування поживного середовища для виробничого культивування у ферментері об'ємом 2,5 м³ (2500 л).

Виробниче культивування проводять у ферментері об'ємом 2,5 м³, для чого готують 1360 л середовища складу, наведеного у табл. 2.4.

Таблиця 2.4

Розрахунок вмісту компонентів для приготування 1360 л середовища

Компонент поживного середовища	Концентрація, г/л	Вміст компонента у 136 л середовища, г	Композиція	Об’єм композиції, л
Меляса	12,0	16440»17000	І	160
дигідрофосфат калію КН2РО4	2,0	2740	ІІ	1200
діамонійфосфат (NH4)2HPO4	2,6	3560
сульфат заліза FeSO4	0,015	20

ДР 2.6.1. Приготування і стерилізація композиції І. 17 кг меляси через об'ємно-ваговий дозатор завантажують у збірник об'ємом 250 л. Відкривають вентиль подачі води питної і подають у збірник 160 л питної води. Вмикають мішалку і проводять перемішування протягом 10±1 хвилин. Після цього починають процес стерилізації подачею гострої пари через нижній спуск апарату. Після досягнення тиску усередині апарату 0,05 МПа за показниками манометра (КТ 2.6.1.) починають відлік часу стерилізації. Процес стерилізації триває 30 хв при температурі 112 °С. У рубашку апарату для зменшення енерговтрат подається глуха пара.

ДР 2.6.2. Приготування композиції ІІ. Через об'ємно-ваговий дозатор сольові компоненти композиції ІІ згідно табл. 2.4 завантажують у збірник об'ємом 2000 л. Відкривають вентиль подачі води водопровідної і подають в апарат 1200 л водопровідної води. Вмикають мішалку і проводять перемішування протягом 10±1 хвилин. У рубашку апарату для інтенсифікації процесу розчинення подається глуха пара. Контроль розчинення проводять візуально (КТ 2.6.2). Для запобігання утворення нерозчинної солі гідрофосфату заліза під час стерилізації, значення рН композиції доводять до 4,5-5,0 додаванням 0,1 н розчину хлоридної кислоти від ДР 1.2. Контроль рН здійснюють за допомогою датчика рН (КТ 2.6.2.).

ДР 2.6.3. Стерилізація композиції ІІ.

У попередньо простерилізований ферментер об'ємом 2,5 м³ за допомогою насосу перекачують композицію ІІ від ДР 2.6.2 та починають процес стерилізації. У апарат через нижній спуск подається гостра пара. Після досягнення тиску усередині апарату 0,15 МПа за показниками манометра (КТ 2.4.2.1) починають відлік часу стерилізації. Процес стерилізації триває 60 хв при температурі 131 °С. У рубашку апарату для зменшення енерговтрат подається глуха пара.

ТП 3. Підготовка посівного матеріалу.

ТП 3.1 Підтримання колекційної культури

Колекційну культуру Bacillus subtilis 1.1. зберігають у пробірках зі скошеним МПА. Пересіви здійснюють кожні 2–3 місяці. Всі роботи з колекційною культурою проводять у суворо асептичних умовах.

ТП 3.2 Одержання робочої культури на агаризованих середовищах

Колекційну культуру, що зберігається в пробірках з МПА, розсівають петлею до ізольованих колоній на чашки Петрі із МПА і вирощують при температурі 35–37 °С упродовж 24 год.

ТП 3.3. Вирощування посівного матеріалу в пробірках.

Отримані ізольовані колонії (від ТП 3.2) пересівають петлею в пробірки зі скошеним МПА (одна ізольована колонія використовується для засіву однієї пробірки). В пробірки пересівають ізольовані колонії, що знаходяться на відстані не менше 1 см. Тривалість вирощування – 24 год. Засіяні пробірки ставлять у термостат з температурою 37 °С та витримують впродовж 12 – 24 год. Контроль за чистотою культури здійснюють мікроскопіюванням.

ТП 3.4. Вирощування посівного матеріалу в колбах на качалках.

У колбу об’ємом 2 л із 1000 мл розчину композиції ІІ (від ДР 2.3.2) в асептичних умовах вносять 260 мл розчину композиції І (від ДР 2.3.1) та 110 мл розчину композиції ІІІ (від ДР 2.3.3). Перемішують і розливають по 130 мл в десять стерильних качалочних колб об’ємом 750 мл.

У пробірку з робочою культурою Bacillus subtilis 1.1., вирощеною на МПА, вносять 5 мл стерильного фізіологічного розчину, суспендують клітини (змивають культуру), стерильною піпеткою відбирають одержану бактеріальну суспензію і вносять у качалочні колби з поживним середовищем. Для засіву однієї колби використовують бактеріальну суспензію, одержану з однієї пробірки.

Вирощування посівного матеріалу у колбах на качалках проводять за наступних умов: температура – 37 °С, частота обертання – 220 об/хв, час вирощування – 12 год.

Після вирощування культуральну рідину з колб переносять у стерильну засівну колбу об’ємом 2 л.

ТП 3.5. Вирощування культури у інокуляторі.

В інокулятор із 11,0 л простерилізованої та охолодженої композиції ІІ (від ДР 2.4.3) асептично передають 1,0 л охолодженого до кімнатної температури стерильного розчину композиції І (від ДР 2.4.1) та 0,1 л охолодженого до кімнатної температури стерильного розчину композиції ІІІ (від ДР 2.4.4). Рівень рН поживного середовища контролюють за показами рН-метра і, за необхідності, доводять до значення рН=7 подачею стерильного розчину гідроксиду натрію (від ДР 1.1.3) трубопроводом всередину інокулятора.

Посівний матеріал із засівної колби (від ДР 3.4), дотримуючись правил асептики, переносять в інокулятор.

Процес культивування ведуть за наступних умов: температура – 37±1 °С, швидкість перемішування – 220 об/хв, час вирощування – 12 год., витрати повітря – 1 л/л×хв, корекцію рівня рН впродовж культивування не проводять, під час вирощування у інокуляторі стерильним стисненим повітрям підтримується надлишковий тиск – 0,02 МПа. (КТ 3.5.)

ТП 3.6. Вирощування культури у посівному апараті.

Охолоджений до кімнатної температури розчини меляси (композиція І) від ДР 2.5.1 асептично перекачують у посівний апарат об'ємом 250 л, у якому міститься стерильний розчин солей тієї ж температури від ДР 2.5.2. та доводять рівень рН до рН=7 стерильним розчином гідроксиду натрію (від ДР 1.1.3).

Засів проводиться перетискуванням стерильним стисненим повітрям посівного матеріалу з інокулятора (від ТП 3.3) через трубу перетискання до посівного апарату.

Процес культивування ведуть за наступних умов: температура – 37±1 °С, швидкість перемішування – 220 об/хв, час вирощування – 12 год., витрати повітря – 1 л/л×хв, корекцію рівня рН впродовж культивування не проводять, під час вирощування у інокуляторі стерильним стисненим повітрям підтримується надлишковий тиск – 0,02 МПа.

ТП 4. Виробниче культивування.

Охолоджений до температури 37±2 ºС розчини меляси (композиція І) від ДР 2.6.1 асептично перекачують у виробничий ферментер об'ємом 2500 л, у якому міститься стерильний розчин солей тієї ж температури від ДР 2.6.2. та в асептичних умовах доводять рівень рН до 7 стерильним розчином гідроксиду натрію (від ДР 1.1.3) (КТ 4.1).

Засів проводиться перетискуванням стерильним стисненим повітрям посівного матеріалу з посівного апарату (від ТП 3.4) через трубу перетискання до ферментера.

Процес культивування ведуть за наступних умов: температура — 37±1 °С, швидкість перемішування – 220 об/хв, час вирощування – 24±2 год., витрати повітря – 1 л/л×хв, корекцію рівня рН впродовж культивування не проводять, під час вирощування у інокуляторі стерильним стисненим повітрям підтримується надлишковий тиск – 0,02 МПа (КТ 4.2).

Культивування ведуть до досягнення концентрації біомаси 5,5 г/л, яку визначають за оптичною густиною культуральної рідини (КТ 4.3).

Отриману культуральну рідину передають далі на отримання цільового продукту.

5.2.12. Контроль виробництва. У цьому підрозділі наводять карту постадійного контролю (хімічного, технологічного та мікробіологічного). Для цього відповідно до опису технологічної схеми необхідно визначити контрольні точки виробництва. До переліку контрольних точок входять лише потрібні для забезпечення коректного ходу технологічного процесу.

Хімічний контроль: визначення концентрації розчинів дезінфікувальних засобів, титрувальних агентів (розчинів кислот, лугів), підживлювальних розчинів тощо; концентрації компонентів поживного середовища; значення рН упродовж процесу.

Технологічний контроль включає в себе параметри процесів приготування та стерилізації розчинів (час, тиск, кількість обертів перемішуючого пристрою); параметри процесів культивування концентрацію біомаси; вміст цільового продукту (концентрація, активність та ін.), значення рН.

Технологічний контроль концентрації джерел вуглецю та азоту у культуральній рідині упродовж виробничого біосинтезу передбачає визначення вмісту конкретних компонентів поживного середовища, що є джерелами вуглецю і азоту (глюкози, етанолу, амонійного чи нітратного азоту), а не елементів С і N.

У разі визначення концентрації позаклітинних продуктів мікробного синтезу ваговим методом необхідно пам’ятати, що на першому етапі потрібно відділити біомасу, а цільовий продукт виділяти (екстрагувати, осаджувати, тощо) з супернатанту культуральної рідини.

Наприклад, для визначення концентрації амінокислоти як позаклітинного цільового продукту методом газо-рідинної чи високоефективної рідинної хроматографії спочатку треба відділити біомасу, з супернатанту культуральної рідини виділити цільову амінокислоту і у вигляді розчину певної концентрації аналізувати її концентрацію хроматографічними методами.

Мікробіологічний контроль: на визначення стерильності поживних середовищ після стерилізації, мікробіологічної чистоти посівного матеріалу (методами мікроскопіювання та висівом на чашки з поживними середовищами) на всіх етапах його підготовки та під час виробничого біосинтезу.

Після карти постадійного контролю обов’язково наводять методики контролю (принцип методу, та хід проведення проведення основних аналізів).

Зразок заповнення карти постадійного контролю представлений у додатку 4.

5.2.14. Графічна частина проекту. Графічна частина проекту включає в себе технологічну схему виробництва. Кількість та формат креслень визначає керівник проекту.

Креслення технологічної схеми виробництва являє собою графічне зображення послідовності технологічних стадій та операцій.

Технологічна схема виробництва має наочно (графічно у вигляді блок-схеми з назвою операції або стадій з переліком технологічних параметрів у них) відображати послідовність виконання робіт виробництва з поділом їх на стадії та операції технологічного процесу, графічним позначенням основних матеріальних потоків (сировини, допоміжних матеріалів, отримання проміжних продуктів) та місць утворення відходів, стічних вод, викидів газів у атмосферу.

Потоки сировини, матеріалів зображують у вигляді ліній зі стрілками. Лінія зв’язку (без стрілки) означає зв’язок між стадіями та операціями технологічної схеми у логічному порядку їх розташування.

Матеріальні потоки, що спрямовуються до операцій, характеризують позначенням фізико-хімічними показників: вміст основної речовини; температура; тиск та інше. Назви матеріальних потоків наводять без скорочень. Наведення формул не допускається.

Кожну операцію закінчують одержанням результату технологічного процесу (продукт, напівпродукт, технологічна дія), який спрямовують за призначенням (адресація).

Технологічну операцію (як складову стадії) зображують окремо з зазначенням відповідності її певній стадії. Кожна стадія і операція мають характеризуватись назвою та індексом, який складається з умовного позначення та порядкового номера.

Нумерація стадій – наскрізна і здійснюється відповідно до порядку їх виконання по ходу технологічного процесу.

Графічно окремі технологічні стадії та операції подаються у вигляді прямокутного блоку зі стрілочками, які рівномірно та послідовно розміщують на полі креслення. Кількість блоків та їх розміри вибирають таким чином аби забезпечити найбільше заповнення поля креслення. Загальна площа усіх блоків, які розміщують на кресленні має бути не менше 28...30 % від загальної площі креслення (за виключенням площі великого штампу). У разі альбомної орієнтації креслення відношення довжини бічної сторони блока до довжини бічної сторони креслення має бути не менше 1:8. Товщину ліній блоку та розмір шрифту надписів блоку вибирають залежно від обраного формату креслення таким чином, аби забезпечити чітке та інформативне зображення (рис.).

Рис. Приклад оформлення операції (стадії) на технологічній схемі виробництва.

У технологічній схемі використовуються такі умовні позначення стадій:

ДР – стадії допоміжних робіт;

ТП – стадії основного технологічного процесу;

ПВ – стадії перероблення отриманих відходів;

ЗВ – стадії знешкодження відходів (твердих, рідких та газоподібних, вентиляційних викидів повітря в атмосферу);

На технологічній схемі показують точки контролю:

Кт - контроль технологічний;

Кх - контроль хімічний.

Км - контроль мікробіологічний

Приклад оформлення фрагмента технологічної схеми виробництва наведено у додатку 5.