5.2. Рекомендації до проектування біотехнологічного виробництва

5.2.1. Вступ. Вступ повинен бути коротким і чітким. Його не слід перевантажувати загальними фразами. На початку вступу визначають актуальність даного проекту у розв’язанні існуючого (поставленого) завдання для розвитку промисловості України.

Визначають новизну запропонованих технологічних рішень. Новизна проекту являє собою суттєві технологічні зміни технології порівняно з базовою (існуючою) технологією.

Новизною технологічної розробки може бути визнана зміна технологічних прийомів (способів виробництва), що сприяють інтенсифікації процесів виділення, очищення та концентрування кінцевого продукту: застосування сучасних способів удосконалення процесів розчинення, фільтрування, сучасні способи сушіння. Новизна, наведена в курсовому проекті, обов‘язково повинна бути підтверджена відповідною сучасною науково-технічною літературою. Наведений у вступі перелік основних новітніх розробок технології потім слід обґрунтувати у розділі “Обґрунтування вибору технологічної схеми”.

Закінчується вступ висновками стосовно вибраної мети проектування.

Обсяг вступу 3 – 4 сторінки.

Розділ “Вступ” не нумерується.

5.2.2. Характеристика кінцевої продукції виробництва.. Характеристика готової продукції приймається за основу в обґрунтуванні вибору технологічної схеми.

Характеристика кінцевої продукції продукту мікробного синтезу (в загальному вигляді) містить:

• назву продукту мікробного синтезу (речовини препарату) українською та латинською (за наявності латинської назви) мовами;

• хімічну формулу (для антибіотиків, вітамінів та інших біологічно активних речовин (БАР) визначеного складу);

• особливі властивості: зовнішній вигляд (колір, інші органолептичні показники); фізико-хімічні показники (розчинність, вміст, активність біологічно активних речовин, вологість, гранулометричний склад, температури плавлення і розкладання, ізоелектрична точка, тощо)

• місце у класифікації БАР (для антибіотиків – класифікація за хімічною будовою, механізмом дії та походженням, для ферментів – місце у міжнародній класифікації ферментів, тощо)

• основне призначення продукції, що охоплює: категорію продукції (харчовий продукт або ветеринарний препарат, проміжний продукт, харчова домішка, державний стандартний зразок тощо); характеристику і галузь використання препарату в харчовій промисловості, медицині, сільському господарстві тощо;

5.2.4. Обґрунтування вибору технологічної схеми виробництва (овтс).

Обґрунтування вибору технологічної схеми біосинтезу проводять по розділах і блоках (стадіях технологічного процесу).

Обґрунтування вибору біологічного агенту. У цьому підрозділі ОВТС аналізують різні роди, види та штами мікроорганізмів, що використовуються як продуценти певної біологічно активної речовини, їх недоліки та переваги. На основі цього аналізу пропонують біологічний агент, який порівняно з іншими має певні переваги (наприклад, здатність до надсинтезу біологічно активної речовини, можливість культивування на простіших та дешевших середовищах, стійкість до контамінації, більш швидкий ріст та ін.).

Обґрунтування вибору умов культивування

На підставі інформації щодо відношення біологічного агента до кисню обґрунтовують вибір рівня аеробності процессу (потреб у розчиненому кисні). Наприклад, відомо, що бактерії виду Escherichia coli є факультативними анаеробами, але промислове культивування цих мікроорганізмів проводять за умов аерації середовища з метою більш ефективного накопичення біомаси. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae також є факультативними анаеробами, але варто пам’ятати, що для ефективного накопичення дріжджової біомаси (одержання хлібопекарських, кормових дріжджів, біомаси для подальшого виділення дріжджових метаболітів, тощо) культивування проводять за аеробних умов, а біосинтез етанолу дріжджами – за анаеробних. Виходячи з чого обґрунтовують вибір режимів перемішування (враховуючи вплив зрізових зусиль на клітини біологічних агентів) та інтенсивності аерації.

Наводять обґрунтування вибору способу проведення біосинтезу на підставі аналізу переваг та недоліків поверхневого (рідиннофазного або твердофазного) та глибинного культивування біологічних агентів. Варто пам’ятати, що поверхневе культивування використовується досить рідко, зважаючи на ряд суттєвих недоліків. Прикладами використання поверхневого культивування можуть бути технології одержання лимонної кислоти (використовується рідко) та деяких ферментних препаратів. Підставою для вибору поверхневого культивування повинні бути наукові статті або патенти останніх років.

Аналізують потребу у забезпеченні стерильних умов біосинтезу. Підставами для проведення біосинтезу в нестерильних (умовно стерильних) умовах є термофільність біологічного агента, гранично низький (або високий) рівень рН середовища культивування, або інші умови, які перешкоджають розвитку сторонньої контамінуючої мікрофлори. Наприклад, умовно асептичним вважається культивування термофільних молочнокислих бактерій Lactobacterium delbrueckii з метою одержання молочної кислоти, яке проводять за умови підвищеної температури (50±1°С) та низьких значень рН середовища (рН = 4,5-5,5).

Базуючись на інформації щодо відношення біологічного агента до температури та рН середовища, обирають режими культивування (зазначають оптимальне значення рН та можливі межі відхилення від оптимального значення), тривалість, тощо.

Розрахунок кількості необхідних стадій підготовки посівного матеріалу

Виходячи із геометричного об’єму виробничого ферментеру (із завдання на проектування) та обраного коефіцієнту його заповнення, необхідно розрахувати кількість стадій підготовки посівного матеріалу, яку розраховують, визначивши робочий об’єм апарату.

Робочий об’єм ферментера (V_роб) визначають за формулою:

V_роб = V_г.ф Ч К_зап, (5.1)

де: V_г.ф. – геометричний об’єм ферментера (заданий керівником);

K_зап – коефіцієнт заповнення*

* варто пам’ятати, що коефіцієнт заповнення ємності (апарату) для культивування залежить від обраного способу культивування і складу поживного середовища, але у загальному: K_зап для культивування на колбах – 0,05 – 0,2 (у колбу об’ємом 750 мл вносять до 150 мл середовища); для аеробного культивування у ферментері 0,5 – 0,7; анаеробного – 0,7 – 0,9. Вибір K_зап залежить від спінюваності компонентів ПС і обраної системи піногасіння.

Кількість посівного матеріалу (доза), як правило, становить 10 % від об’єму поживного середовища (робочого об’єму ферментера). Інша доза може бути обрана згідно проведеного патентного пошуку або за рекомендацією керівника проекту.

Максимальний об’єм посівного матеріалу, який можна приготувати в колбах на качалці, становить до 3 л. Одержання більших об’ємів інокуляту здійснюється у посівних апаратах, інокуляторах.

Приклад наведення розрахунку кількості стадій одержання посівного матеріалу

Виробниче культивування Corynebacterium glutamicum для одержання глутамінової кислоти здійснюють у ферментері об’ємом 100 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,6. Робочий об’єм ферментера становить:

V_роб = 100Ч 0,6 = 60 м³.

Кількість посівного матеріалу (доза) становить 10 % від об’єму поживного середовища. Отже, для одержання 60 м³ культуральної рідини потрібно:

V_роб.1 = 60 Ч 0,1 = 6 м³ посівного матеріалу.

Таку кількість інокуляту можна одержати під час культивування бактерій у посівному апараті об’ємом 10 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,6.

Для засіву посівного апарату (одержання 6 м³ культуральної рідини) необхідно:

V_роб.2 = 6 Ч 0,1 = 0,6 м³ посівного матеріалу.

Таку кількість посівного матеріалу можна одержати у процесі вирощування бактерій у посівному апараті об’ємом 1 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,6.

0,6 м³ (600 л) культуральної рідини можна одержати з використанням

V_роб.3 = 600 Ч 0,1 = 60 л посівного матеріалу.

Приготування такої кількості інокуляту здійснюють в інокуляторі об’ємом 0,1 м³ (100 л) з коефіцієнтом заповнення 0,6.

Для одержання 60 л культуральної рідини потрібно мати:

V_роб.4 = 60 Ч 0,1 = 6 л посівного матеріалу

Таку кількість посівного одержують культивуванням біологічного агента в інокуляторі об’ємом 10 л.

Для отримання 6 л культуральної рідини потрібно мати:

V_роб.5 = 6 Ч 0,1 = 0,6 л посівного матеріалу

Таку кількість інокуляту можна одержати культивуванням бактерій у колбах на качалці.

Отже, процес одержання посівного матеріалу для забезпечення виробничого біосинтезу глутамінової кислоти у ферментері об’ємом 100 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,6 буде проходити у п’ять етапів.

Наведення складу поживного середовища

У цьому підрозділі необхідно навести склад поживного середовища (ПС), яке буде використовуватися для вирощування біологічного агента з метою одержання певного продукту мікробного синтезу. Склад ПС обирають згідно нормативно-технічної (патент, авторське свідоцтво, регламент виробництва), наукової (наукова стаття, дисертація) або навчальної (підручник, навчальний посібник) літератури. Вибираючи склад поживного середовища, треба орієнтуватися на те літературне джерело, з якого обрано біологічний агент.

Склад ПС треба наводити із зазначенням кількості кожного компонента (у г/л).

Обґрунтування способу приготування і стерилізації поживного середовища для одержання інокуляту і виробничого біосинтезу.

Спираючись на склад поживного середовища, наведений у попередньому підрозділі, необхідно обгрунтувати послідовність операцій та режими його приготування до проведення біосинтезу.

• Приготування. Для приготування поживних середовищ водорозчинні джерела вуглецю, наприклад, цукор, розчиняють у питній воді (глюкозу – у дистильованій). Мелясу для культивування дріжджів попередньо піддають освітленню (обробленню 1 н розчином сульфатної кислоти до рН 4,0–4,4, попередньо розбавивши мелясу питною водою (1:1 або 1:2) з подальшим відокремленням утвореного осаду для видалення надлишку іонів кальцію). Нерозчинні субстрати, як правило, потребують додаткових операцій попередньої обробки, наприклад, соєве борошно або крейду ретельно суспендують, крохмалевмісну сировину (пшеничне, кукурудзяне борошно) розварюють.

Для нагрівання середовищ, як правило, використовують глуху пару (теплообмін відбувається через стінку) або гарячу воду подачею їх у рубашку апарату.

Треба пам’ятати, що розчинення, суспендування та розварювання компонентів поживного середовища проводять у окремих збірниках. Ці операції не можуть відбуватися в апаратах для культивування мікроорганізмів (інокуляторах, посівних апаратах, ферментерах).

• Стерилізація. Вибір режиму стерилізації речовини визначається за температурою її розкладання, тому усі компоненти середовища поживного середовища необхідно розподілити на окремі композиції, враховуючи їх термолабільність, а також враховуючи можливість утворення нерозчиннів осадів компонентів під час нагрівання.

Якщо у середовищі є кілька термолабільних компонентів (глюкоза, дріжджовий автолізат), їх можна готувати в одному розчині. Якщо об’єм розчину (компонента середовища) невеликий (наприклад, 5−6 л), його стерилізують в автоклаві.

Стерилізацію більших об’ємів поживних середовищ можна проводити двома способами: періодичним (для інокуляторів і посівних апаратів з об’ємами поживних середовищ до 10м³) і безперервним (як правило, використовується для об’ємів поживних середовищ понад 10м³).

Окремо від солей кальцію і магнію готують розчини фосфорних солей (для запобігання утворенню нерозчинних фосфатів кальцію і магнію). Можна всі солі розчиняти разом, але перед стерилізацією довести рН до 4,5−5,0 (у цьому разі осади фосфатів кальцію і магнію не утворюються). Після охолодження перед внесенням посівного матеріалу рН треба довести до оптимального рівня. У разі використання такого способу приготування і стерилізації поживного середовища у технологічній схемі (допоміжні роботи) необхідно передбачити приготування відповідних розчинів кислоти (зазвичай 6% соляна кислота) і лугу (зазвичай розчин аміаку чи 6 % гідроксид натрію).

Розчини джерел мікроелементів, як правило, готують і стерилізують окремо.

Температура та тривалість стерилізації залежать від складу поживного середовища. Так, молоко, желатинові середовища та середовища, які містять вуглеводи, деякі вітаміни та амінокислоти стерилізують при температурі 112–115 °С і під тиском 0,05 МПа впродовж 20–30 хв, м’ясо-пептонні середовища – при 120 °С (0,075–0,1 МПа) впродовж 20–30 хв, розчини солей – при 131 °С (0,15 МПа) впродовж 40–60 хв.

Розчини термолабільних компонентів поживного середовища, які не витримують умов термічної стерилізації (наприклад, деякі амінокислоти, деякі вітаміни) піддають стерилізуючій фільтрації.

Обґрунтування вибору технологічної схеми закінчується висновками стосовно обраного біологічного агента, способу культивування (із зазначенням особливостей культивування) та розрахованої кількості стадій підготовки посівного матеріалу і наведенням складу композицій поживного середовища.

Приклад висновку до ОВТС:

Висновок. Обраний для виробництва пробіотиків штам B. subtilis 1.1, на відміну від штамів, які наразі використовуються, виявляє не лише антагоністичну активність відносно патогенних мікроорганізмів, а й продукує широкий спектр гідролітичних ферментів та сполуку каротиноїдної природи, що робить його перспективним компонентом легкозасвоюваних кормів з пробіотичними та провітамінними властивостями [1].

Для культивування термотолерантного аеробного мікроорганізму B. subtilis 1.1 обрано періодичне глибинне культивування за таких умов: температура – 37±1 °С, інтенсивність аерації 1 л/л×хв, інтенсивність перемішування – 220 об/хв, корекцію рівня рН упродовж культивування не проводять [2] .

Розраховано, що для виробничого культивування продуцента у ферментері об’ємом 5 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,6 процес одержання посівного матеріалу буде проходити у три етапи.

Для вирощування B.subtilis 1.1 обрано поживне середовище складу (г/л): глюкоза - 20,0; дигідрофосфат калію (КН₂РО₄) - 9,6; діамонійфосфат ((NH₄)₂HPO₄) - 4,75; цитрат натрію (Na₃C₆H₅O₇) - 1,28; сульфат магнію (MgSO₄ ×7Н₂О) - 0,18. Для приготування його необхідно розділити на такі композиції (залежно від режиму стерилізації та можливого взаємного впливу певних компонентів):

Композиція І: глюкоза (меляса для виробничого культивування) (режим стерилізації: 112°С, 30 хв).

Композиція ІІ: дигідрофосфат калію (КН₂РО₄), діамонійфосфат ((NH₄)₂HPO₄), цитрат натрію (Na₃C₆H₅O₇) (режим стерилізації: 131°С, 50 хв).

Композиція ІІІ: сульфат магнію (MgSO_4×7Н₂О) (режим стерилізації: 131°С, 50 хв) винесений у окрему композицію, оскільки за умови спільної стерилізації із іншими солями можливе утворення нерозчинного фосфату магнію.

5.2.4. Характеристика біологічного агента. В цьому розділі проекту наводять сукупність морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних ознак біологічного агента, вибір якого обгрунтований у попередньому розділі. Обов’язково треба навести таксономічний статус біологічного агента згідно філогенетичної систематики.

Якщо штам біологічного агента є мутантним або генно-модифікованим, необхідно навести спосіб одержання такого штаму із зазначенням мети, з якою проводились маніпуляції (розширення спектру субстратів, які здатний споживати біологічний агент, блокування певних метаболічних шляхів для одержання надсинтезу цільового продукту, тощо). Інформацію треба наводити, користуючись тим літературним джерелом, звідки обрано штам біологічного агента та склад поживного середовища.

Необхідно також навести схему біосинтезу цільового продукту, починаючи з реакцій метаболізму ростового субстрату (джерела вуглецю та енергії в середовищі культивування). Бажано вказати, які ферменти здійснюють ті чи інші перетворення, Обов’язково треба навести ключові ферменти катаболізму ростового субстрату. Складаючи схему біосинтезу, потрібно враховувати конкретні шляхи катаболізму певного субстрату, які функціонують в клітинах даного біологічного агента.

У разі, коли схема біосинтезу цільового продукту не вміщується у формат креслення А4, її подають окремо на форматах креслення А3, А2, А1 та розміщують у додатках до пояснювальної записки.

Приклад наведення характеристики біологічного агента

Продуцентом ферментного препарату целюлолітичної дії є новий селекціонований штам міцеліального гриба Penіcіllіum funіculosum S-2006, який здатний синтезувати комплекс карбогідраз, що містить целюлази, b-глюканази, b-глюкозидази (целобіази), ксиланази й ксилоглюканази.