Разновидности биосенсоров и их применение.

Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет собой одну из ветвей современной биотехнологии. Существует несколько типов биосенсоров.

Ферментные биосенсоры могут быть представлены ферментными электродами, ферментными микрокалориметрическими датчиками, биодатчиками на основе хеми- и биолюминесценции. Принцип рабoты биосенсора достаточно прост. Определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, где и протекает ферментативная реакция.

Если при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образуется электрохимически активное соединение, то, контролируя содержание последнего, можно контролировать ферментативную реакцию. Однако в присутствии веществ, являющихся ингибиторами, активность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, регистрируемому электродом. [11]

Ферментные (безреагентные) электроды  — устройства, основанные на применении электрохимического способа определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Представляют собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (чаще всего природный полимер), содержащим один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворенном состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). В зависимости от типа взятого за основу электрода, устройства подразделяют на потенциометрические и амперометрические.

Электроды с иммобилизованными ферментами во много раз долговечнее и позволяют провести несколько сот измерений по сравнению с электродами, в которых используются естественные ферментные препараты (около 50 испытаний). В ходе иммобилизации с помощью специальных реагентов фермент "закрепляют" либо на поверхности адсорбентов, например силикагеля, угля или целлюлозы, либо вводят в пленку пористого полимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей, "пришивают" к какой-либо подложке. При этом фермент закрепляется, перестает быть пoдвижным, не вымывается из биoслoя, а его каталитическое действие сохраняется. Биoсенсoры могут быть сконструированы по объемной технологии.

Ферментные микрокалориметрические датчики — устройства на основе использования теплового эффекта ферментативной реакции. Состоят из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носителем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисторами. При пропускании через измерительную колонку анализируемого образца происходит химическая реакция, которая сопровождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью.

Хеми- и биолюминесцентные датчики — регистрируют световое излучение с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции в возбужденном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизованными на носителе ферментами (люциферазой, пероксидазой) и светоприемное устройство. Метод характеризуется крайне высокой чувствительностью, позволяя определять фемтомольные (10^-12 М) количества вещества.

В настоящее время наиболее широко распространен амперометрический биосенсор для определения сахара в крови (на основе иммобилизованной глюкозоксидазы). В качестве физического трансдьюсера в нем использован электрод Кларка. [11]

Для контроля содержания пенициллина в питательной среде для выращивания бактерий используют пенициллиновый электрод — рН-датчик, покрытый иммобилизованным ферментом пенициллазой.

Биосенсоры, основанные на кислородном электроде, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты.

С помощью биосенсоров можно решать и обратную задачу: при некоторой определенной концентрации субстрата по величине измеряемого сигнала оценивать активность самого фермента. Такое применение биосенсоров позволяет измерить активность большого числа ферментов. Оценка активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью (аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа), дает возможность в клинических условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы используют в педиатрии.

Многие ферменты дoрoги и быстрo теряют свoю активность. Применение бактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения более предпочтительно, поскольку в данном случае oтпадает необходимость в предварительном получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких биосенсоров можно отнести низкую селективность вследствие того, что клетки живых организмов фактически являются источником самых разнообразных ферментов. Помимо этого время отклика биосенсоров на oснове тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим. [12]

Антитела вырабатываются В-лимфоцитами в ответ на антигенные стимулы. При их использовании в качестве биосенсоров, антитела иммобилизуют на поверхности датчика через ковалентное сопряжение аминных, карбоксильных, альдегидных или сульфгидрильных группы. Антитела чувствительны к изменениям рН, ионной силы, химических ингибиторов и температуры. Иммунные датчики обычно используют оптические, флуоресцентные или акустические преобразователи.

Клеточные биосенсоры. Одно из достижений биотехнологии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы.

Методы иммобилизации клеток сходны с методами иммобилизации отдельных ферментов. Стабильность иммобилизованных клеток определяется их метаболизмом, свойствами носителя и среды. Первоначально для иммобилизации клеток с сохранением их активности применяли материалы природного происхождения: желатин, агар, альгинат кальция, каррагинан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели.

Наибольшее применение для иммобилизации нашли клетки микроорганизмов, которые легко культивируются, воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре, а также клетки растений, животных, человека. В отличие от ферментов, при их использовании не требуется дорогостоящих стадий очистки. [11]

Имеющиеся методы позволяют получить клетки, сохраняющие около 100 % активности ферментов и способные функционировать длительные промежутки времени (до нескольких лет). Клетки, как правило, сохраняют все системы жизнеобеспечения, что позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.

Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны эффективные методы генетических трансформаций, позволяющие получать мутанты с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать высокоэффективными каталитическими системами. Клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка. На основе этого могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики.

Основные недостатки клеточных биосенсоров заключаются в медленном отклике электрода (что связано с необходимостью использовать толстые мембраны), а также в сравнительно низкой селективности, обусловленной присутствием в клетке или тканях нескольких ферментных систем. В процессе роста и размножения интактные клетки разрушают носитель, а дочерние клетки загрязняют получаемый продукт. Эта проблема решается торможением роста, что достигается созданием дефицита фитогормонов для иммобилизованных клеток растений либо добавлением антибиотиков при применении клеток бактерий.

Биоселективные датчики создают путем нанесения на поверхность ионоселективных электродов целых клеток микроорганизмов или тканей. Для биосенсоров используют различные микроорганизмы: Neigrospora europea — для определения аммиака, Trichosporon brassicae — для определения уксусной кислоты, Sarcina flava — для определения глутамина, Azotobacter vinelaudit — для определения нитратов. На основе гриба Aspergillus niger группой японских ученых созданы биосенсоры для определения биогенных аминов.

Биосенсор на основе иммобилизованных дрожжей между двумя пористыми мембранами и кислородного электрода позволяет определять этанол и метанол, например в промышленных стоках.

Иммобилизованные клетки нашли применение и для синтеза разнообразных химических соединений биотехнологическим способом. Причем биотехнологический синтез предпочтительнее для пищевой и фармакологической промышленности, так как в этом случае продукты получаются более чистыми и дешевыми.

В тканевых электродах нашли применение срезы почек и печени свиньи, желтой тыквы, банана. [11]

Тканевые срезы в биосенсорах могут выполнять функцию источников каталитической активности. Тканевые материалы достаточно долго сохраняют высокую специфичность, что очень важно для биосенсора, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях быстро разрушаются. [12]

Так, создан биосенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из электрода Кларка и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна для проведения 50-80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-ном глицерине.

Аналогичный подход использовали при создании конструкции биосенсора на допамин. В данном биoсенсoре ткань плода банана была иммoбилизoвана на пoверхности кислородного электрода. Известны биосенсоры, в которых испoльзoван цельный фрагмент ткани печени быка, являющийся носителем фермента каталазы и иммобилизованный на кислородном электроде.

Прогресс не стоит на месте. В последнее время биоинженеры разработывают ультрачувствительные биосенсоры. В качестве одного из примеров можно привести биосенсор, основу которого составляет графен на основе карбида кремния, который устойчив к чрезвычайно высоким температурам и давлению. Графен имеет превосходные электронные транспортные свойства и высокое соотношение внутренней поверхности к объему, что делает её идеальным материалом для изготовления биосенсоров.

Данный биосенсор обнаруживает биомаркеры рака в крови, слюне и моче. Молекула 8-дегидродеоксигуанозина (8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHdG) появляется в повышенном количестве при повреждении ДНК и связана с повышенным риском развития некоторых форм рака.

Команда исследователей использовала рентгено-фотоэлектронную спектроскопию и спектроскопию комбинационного рассеяния, для подтверждения, что молекулы биорецептора прикрепились к графеновому биосенсору. Когда 8-OHdG связывается с молекулами биорецептора, датчик регистрирует заметное различие в сопротивлении графен-канала. Графеновый биодатчик способен обнаруживать 8-OHdG в низкой концентрации – менее 0,1 нг/мл, что почти в пять раз чувствительнее, чем с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Графеновый биосенсор может также значительно быстрее обнаруживать молекулы-мишени. Ответ готов в течение считанных минут.

Универсальные эпитаксиальные графеновые биодатчики могут быть пригодны для диагностики и мониторинга целого ряда заболеваний, поскольку довольно просто установить конкретные рецепторные молекулы на поверхности графена. [7]

Исследователи из лаборатории нанооптики и плазмоники смогли повысить чувствительность биосенсоров на основе поверхностного плазмонного резонанса с помощью оксида графена.  Как и у любого колебания, у плазменных есть своя частота, а значит, возможно явление резонанса. Плазмонный резонанс возникает, когда луч падающего света фиксированной частоты находится под определённым углом к поверхности, в результате нарушаются условия полного внутреннего отражения и интенсивность отражённого луча падает. Плазмонный резонанс весьма чувствителен к условиям, и если мы возьмём очень тонкий слой металла — толщиной меньше длины волны, — то резонанс будет сильно зависеть от свойств этой самой поверхности. Даже небольшие изменения в структуре поверхности заметно сдвигают условия возникновения резонанса, что позволяет использовать этот эффект для обнаружения сверхмалых количеств веществ. Как оказалось, сенсоры, в которых использовался оксид графена, в 3—4 раза чувствительнее сенсоров на чистом графене. Кроме того, «оксидный» сенсор после несложной процедуры очистки можно использовать ещё несколько раз. [5]

Появляется новый тип полупроводников, проводящую функцию в которых осуществляют молекулы белков. Такие ферментные системы работают с большей скоростью, чем кремниевые полупроводники. Биочипы имеют небольшие размеры, надежны и способны к самосборке. Японская компания Sony, запатентовала способ производства высококачественных акустических систем из целлюлозы, образуемой бактериями. Гелеобразная целлюлоза высушивается. Полученный материал имеет структуру сот и используется в качестве плоской диафрагмы акустических систем.