Противовирусный иммунитет

Тем не менее, комплемент не рассматривают как главный фактор защиты против вирусов, поскольку при недостаточности компонентов системы комплемента не отмечено предрасположенности к тяжелым вирусным инфекциям у человека. Антитела мобилизуют комплемент и/или эффекторные клетки для разрушения инфицированных вирусами клеток организма. Действие антител, помимо нейтрализации внеклеточных вирусов, состоит в том, что они вызывают разрушение инфицированных вирусами клеток, активируя систему комплемента. В результате его активации происходит сборка лизирующего мембрану комплекса и лизис зараженных клеток. Комплементзависимый цитолиз возможен лишь при высокой плотности экспрессии вирусных антигенов на клеточной мембране.

В противоположность этому, для лизиса по механизму АЗКЦ необходимо присутствие на поверхности клетки-мишени лишь 10³ молекул IgG – такое количество обеспечивает связывание с ней З-х К-клеток. Эти клетки связываются с нагруженной антителами мишенью через FcγRIll и быстро разрушают ее посредством перфоринов. Насколько важен in vivo каждый из этих механизмов, пока трудно понять. Лучшее доказательство в пользу АЗКЦ получено на мышах при изучении защитного эффекта противовирусных моноклональных антител; не проявляя нейтрализующей активности in vitro, они оказались способны защитить С5-дефицитных животных при введении им высокой дозы вируса.

Т-клетки участвуют в формировании и действии противовирусного иммунитета несколькими путями. В иммунитете к вирусным инфекциям Т-клетки выполняют разнообразные функции. Образование антител в ответ на большинство антигенов зависит от тимуса, поскольку для переключения изотипа и созревания аффинности необходимо участие Т-клеток CD4⁺. Кроме того, эти клетки помогают в индукции цитотоксических Т-клеток CD8⁺, а также в привлечении макрофагов в очаг вирусной инфекции и в их активации.

Цитотоксические Т-клетки CD8⁺. Это главная Т-клеточная система для осуществления в организме противовирусного иммунологического надзора, и действует она весьма эффективно и избирательно. Цитотоксические Т-клетки CD8⁺, рестриктированные по антигенам МНС класса I, скапливаются в очагах размножения вирусов и разрушают инфицированные ими клетки. Данный механизм иммунологического надзора, по-видимому, весьма важен, так как фактически все клетки тела экспрессируют молекулы МНС класса 1.

Процессинг и презентация вирусных белков. Вероятно, любой вирусный белок может быть процессирован в цитоплазме АПК с образованием пептидов, которые затем транспортируются к эндоплазматическому ретикулуму и ассоциируют с молекулами МНС класса I. Для организма-хозяина это создает определенные преимущества, так как белки вируса, экспрессируемые клеткой в начале цикла его размножения, становятся доступными для Т-клеточного распознавания задолго до появления нового поколения вирусных частиц. Т-клетки CD4⁺ способны выполнять важные эффекторные функции в иммунном ответе на вирусную инфекцию. В иммунном ответе на инфекцию эпителиальных покровов, вызванную вирусом простого герпеса 1 типа, главной эффекторной клеточной популяцией служат Т-клетки CD4⁺. Они, как и в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, мобилизуют и привлекают макрофаги, и это ускоряет ликвидацию вируса. Макрофаги служат важными участниками этого процесса. В качестве ключевых цитокинов в ответе на герпесвирусную инфекцию действует ИФНγ, необходимый для активации моноцитов, и фактор некроза опухолей, оказывающий ряд противовирусных эффектов, сходных с эффектами ИФНγ, но осуществляемых иными путями. При заражении вирусом кори в организме образуются цитотоксические Т-клетки CD4⁺, которые распознают и лизируют инфицированные вирусом клетки-мишени, экспрессирующие молекулы МНС класса II. Это указывает, что процессинг и презентация антигенов вируса кори происходят обычным способом – путем фагоцитоза и расщепления. Однако существует, предположительно, и другой, еще неизвестный механизм, посредством которого белки или пептиды вируса кори перемещаются из цитозоля в везикулы класса II.

Антитела могут удалять вирусные антигены с плазматической мембраны клетки путем «кэппинга». Именно этот механизм, возможно, ограничивает развитие некоторых вирусов персистенцией внутри клеток. Герпесвирусы кодируют гликопротеины, связывающие IgG через Fc-фрагмент, т. е. обладают FcγR-активностью, которая нарушает активацию комплемента и блокирует действие противовирусных антител. Некоторые вирусы способны противодействовать эффекту интерферонов: они продуцируют короткие отрезки РНК, которые конкурируют за протеинкиназу и каким-то образом подавляют активацию этого фермента. Ряд вирусов кодирует белки, ингибирующие перенос молекул МНС класса I на плазматическую мембрану клетки. Это дает вирусу преимущество, помогая избежать распознавания цитотоксическими Т-клетками.

Отдельные вирусы обладают генами белков, гомологичных цитокиновым рецепторам или даже самим цитокинам. Синтез и выделение из инфицированных клеток этих белков, в частности, растворимых форм рецепторов к ИЛ, ФНО и ИФНγ, нарушают локальное действие опосредованных цитокинами защитных механизмов. Вирус Эпштейна-Барр, например, кодирует белок, гомологичный ИЛ-10 млекопитающих и имитирующий его активность in vitro. Полностью значение подобных продуктов вирусного генома in vivo еще предстоит выяснить. Иммунный ответ на вирусные антигены может вызывать повреждения тканей.

Нарушения, связанные с иммунными комплексами. Иммунные комплексы могут появляться в различных жидкостях организма или на поверхности клеток, чаще всего при хронических, а также при персистентных инфекциях, вызванных, например, вирусами лимфоцитарного хориоменингита либо гепатита В. При избытке вирусного антигена антитела теряют способность нейтрализовывать вирусы; вместо этого они образуют иммунные комплексы, которые оседают в почках или в кровеносных сосудах других органов и вызывают там воспалительные реакции, чреватые повреждением тканей, например такие, как гломерулонефрит.

Связывание вирусов антителами, лишенными нейтрализующей активности, иногда имеет еще одно необычное патологическое следствие: эти иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецептором поглощаются макрофагами, в которых инфекционность вируса усиливается. Это можно наблюдать при инфекции, вызванной вирусом Денге. С Fc-рецепторными взаимодействиями иммунных комплексов, вызывающими гиперактивацию системы комплемента, связан также патогенез геморрагической лихорадки и шокового синдрома Денге.

Повреждение тканей хозяина цитотоксическими Т-клетками.

При любой вирусной инфекции некоторая часть тканевых повреждений вызвана Т-клеточной активностью. Таким образом, именно Т-клетки, а не вирусы, повреждают ткани мозга. Подобный механизм предположительно действует в патогенезе хронического активного гепатита у человека. Вирусы способны инфицировать клетки иммунной системы. Некоторые вирусы непосредственно инфицируют лимфоциты и макрофаги, вызывая патогенный эффект. Кроме того, иммунокомпетентные клетки служат для вирусов благоприятным местом персистенции. Вирусы в неинфекционной форме локализуются в покоящихся лейкоцитах, активация которых может вызвать и реактивацию вирусов с репликацией инфекционных вирионов. Вирус иммунодефицита человека инфицирует Т-клетки CD4⁺. Элиминации вируса не происходит по различным причинам, в том числе из-за его латентной персистенции, мутирования и прогрессирующей иммунологической недостаточности.

Вирусная инфекция может провоцировать аутоиммунные заболевания. Вирусный патогенез аутоиммунных болезней имеет несколько механизмов. Индуцированное вирусами повреждение тканей. Некоторые вирусные инфекции вызывают повреждение тканей и последующую воспалительную реакцию, в результате которой начинают экспонироваться ранее «скрытые» собственные антигены; они могут пройти процессинг и быть презентированы клеткам иммунной системы.

Таким образом, противовирусный иммунитет формируется в результате сочетания факторов неспецифической (естественной) резистентности (воспалительной реакции, интерферонов, противовирусных ингибиторов, естественных киллеров, макрофагов и др.) и специфических факторов (иммуноглобулинов, В- и Т-лимфоцитов).

3. Изучить реакции иммунитета при вирусных инфекциях (записать в тетрадь, оформить протокол):

3.1. Реакция нейтрализации вируса (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Реакция нейтрализации вируса основана на способности проти­вовирусных антител, погашать инфекционное действие вируса.

Источником вируса в реакции служат жидкости и экстракты инфицированных культур клеток, куриных эмбрионов, органов зараженных животных. Вируссодержащий материал освобождают от крупных, частиц, гомогенизируют и титруют для выяснения его биологической актив­ности. Источником антител служат иммунные сыворотки или парные сыворотки больных. Реакция нейтрализации широко используется в диагностике вирусных инфекций, как для обнаружения антител, так и для определения типа выделенного вируса. Нейтрализующее действие антител можно обнаружить в опытах на животных. Для этого вируссодержащий материал смешивают с сывороткой, выдерживают смесь 1–2 часа и вводят животным. Если вирус нейтрализован антителами, животное не погибает.

Реакцию нейтрализации можно поставить в культуре ткани. В этом случае реакцию ставят тремя способами: 1) с учетом результа­тов по цитопатогенному эффекту; 2) методом цветной пробы; 3) по гемадсорбции.

Для постановки реакции с учетом результатов по цитопатогенному эффекту готовят разведения вируса кратные десяти для определения титра вируса и заражают однослойную культуру ткани. Через 5-7 дней клеточный слой разрушается, за титр вируса принимают то его наибольшее разведение, которое вызывает дегенерацию 50% клеток. После этого разведения сыворотки смешивают с ранними объемами вируссодержащего материала в определенной дозе и после часовой экспозиции эту смесь вносят в пробирки с однослойной культурой ткани. Опыт сопровождается контролями: роста вируса, жизнеспособности клеток. Все пробирки помещают в термостат при 37°С, ежедневно просматривают пробирки, через 4–6 суток учи­тывают результат. В опытных пробирках вирус будет нейтрализован антителами, и клетки культуры ткани будут нормальными, в контроле вируса произойдет дегенерация клеток. Титр сыворотки – это наибольшее разведение сыворотки, которое предотвращает дегенера­цию клеток. Тип вируса определяют по типоспецифической сыворотке, предупреждающей развитие дегенерации и культуре ткани.

3.2. Цветная проба (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток. Это определяют по цвету индикатора, содержащегося в питательной среде. В незараженных клетках выражен метаболизм, выделяются кислые продукты в пи­тательную среду, изменяя рН в кислую сторону, и индикатор фенолрот из красного становится желтым. При заражении клетки вирусом в ней происходят дегенеративные изменения, активность метаболизма подавляется, цвет индикатора остается красным (не меняется). Специфические сыворотки, взаимодействуя с вирусом, нейтрализуют его, клетки остаются жизнеспособными, метаболизм не подавлен, рН сдвигается в кислую сторону, среда желтеет. Реакцию ставят на перевиваемых культурах клеток: HЕP-2, СОЦ, НЕLa и др.

Реакцию цветной пробы применяют для идентификации и дифференциации выделенных вирусов (таблица 2). Предварительно вирус титруют, опре­деляют цитопатическую дозу. Для этого определяют титр вируса. За титр вируса принимают то его наибольшее разведение, при котором наблюдается подавление метаболизма разведения вируссодержащего материала кратные 10, и определенный объем каждо­го разведения смешивают с равным объемом клеток в определенной дозе. После 5-суточного инкубирования клеток при 37°С учитывают реакцию (цвет индикатора в среде не изменяется). В качестве антигена используют вирусный диагностикум.

После определения титра вируса смешивают определенную его дозу с типоспецифической противовирусной сывороткой, инкубируют 1 час при комнатной температуре и этой смесью заражают взвесь клеток культуры ткани. Опыт сопровождается контролями. Все пробир­ки инкубируют в термостате от 4 до 9 дней. Изменение цвета индикатора в желтый говорит о нейтрализации вируса соответствующими антителами и позволяет определить вид вируса. Сохранение исходного цвета индикатора говорит о несоответствии вируса типу антител сыворотки.

Цветная проба для определения антител в сыворотке крови больных людей. Используются парные сыворотки для обнаружения прироста антител. Первую сыворотку берут в первые дни заболевания, вторую – на 15–20 день от начала заболевания. Сыворотки исследуют одномоментно, перед постановкой реакции сыворотки прогревают при 56–60°С в течение 30 мин для разрушения термолабильных ингибиторов.

Титрование антител в сыворотке №2 проводят аналогично.

Через 4–6 суток просматривают пробирки, учитывают результат и определяют титр сыворотки. За титр сыворотки принимает то ее наибольшее разведение, которое полностью нейтрализует вирус. Его определяют по пробирке с наибольшим разведением, окрашенным в желтый цвет. Рассчитывают прирост антител в сыворотке №2 по сравнению с сывороткой №1. Достоверным является увеличение титра антител не менее чем в 4 раза.

Таблица 2

Схема проведения цветной пробы

Ингредиенты	1	2	3	4	5	6	7	8
							контроль
Сыворотка больного №1 в разведениях	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	с-ки		клеток
	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25 1:10		-
Питательная среда	-	-	-	-	-	-	0,25		0,25
Вирусный диагностикум одного из типов по 100 ЦПД50 на пробирку	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-		-
Взвесь клеток 300-400 тыс./мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25		0,25
Вазелиновое масло	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4		0,4

3.3. Реакция гемагглютинации (РГА) для определения титра вируса по схеме (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Перед постановкой РТГА определяют дозу вируса, которая соответствует четырехкратному увеличению титра – 4 АЕ. Титр вируса определяют в реакции гемагглютинации. За 1 АЕ принимают максимальное разведение вируса, дающее гемагглютинацию не менее чем на два плюса. Пластину встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Учитывают результат, определяют 1АЕ и рассчитывают 4 АЕ. Например: 1 АЕ = 1:32, 4 АЕ равно 1:8 (таблица 3).

3.4. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) для типирования вируса (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Реакция торможения гемагглютинации основана на способности противовирусных антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вирусов. Реакцию ставят в развернутом ряду, используя пластины из органического стекла с лунками. Реакцию торможения гемагглютинации ставят с типоспецифическими диагностическими противовирусными сыворотками (таблица 4). Пластину встряхивают и оставляют при комнатной температуре до оседания эритроцитов в контроле.

Учет результата. При соответствии типа вируса антителам произойдет торможение гемагглютинации и осадок эритроцитов будет выглядеть так же как в контроле сыворотки – в виде «пуговки». Если вирус не соответствует антителам, произойдет гемагглютинация, и осадок эритроцитов будет выглядеть так же, как в контроле вируса – в виде «зонтика». По проведенному исследованию делают заключение о типе выделенного вируса. С другими типоспецифическими сыворотками реакция ставится аналогично.

Таблица 3