Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 2 академических часа (90 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме: «Противовирусный иммунитет» – 40 мин

1. Неспецифические факторы противовирусного иммунитета: тканевая ареактивность, интерферон, ингибиторы сыворотки крови. Их свойства, механизм действия

2. Реакции иммунитета при вирусных инфекциях: преципитации, РНГА, РСК, нейтрализации вируса, РТГА, торможения гемадсорбции, методы постановки

3. Принцип метода и вариант реакций цитотоксичности. Цитотоксический тест (ЦТТ) с анти-Т-сывороткой

4. Характеристика компонентов реакции ЦТТ. Подготовка к проведению ЦТТ

4. Выполнение практической работы – 30 мин

Практическая работа

1. Изучить противовирусное действие интерферона (ИФН) (нарисовать схему противовирусного действия интерферонов, записать свойства интерферонов)

Практически все вирусы обусловливают выработку интерферонов, их образование является одной из первых защитных реакций организма на внедрение вирусов. Интерфероны, в отличие от антител, подавляют внутриклеточные этапы репродукции вирусов в зараженных клетках и обеспечивают невосприимчивость к вирусам окружающих здоровых клеток. Попадая из ворот инфекции в кровь, интерфероны распределяются по организму, предотвращая последующую диссеминацию вирусов. Наблюдается широкая индивидуальная вариабельность и способность организма к иммунному ответу.

Известно три типа интерферонов:

• ИФНα – лейкоцитарный интерферон;

• ИФНβ – фибробластный интерферон

• ИФНγ – иммунный интерферон.

Основные свойства интерферонов представлены в таблице 1

Таблица 1

Свойства интерферонов

Показатели	ИФНa		ИФНb	ИФНg
Клетки-продуценты	лейкоциты		фибробласты	Т-лимфоциты
Количество изотипов	>20		>5	1
Индукторы	вирусы, бактериа-льные продукты		синтетические митогены	Т-лимфоциты, антигены
Антигенная специфичность	+		+	+
Устойчивость при рН=9,0	+		+	-
При температуре 56оС (1 час)	Устойчив		Устойчив	Устойчив
Молекулярная масса (кД)	17,5–22		20	38–68
Биологическая активность	Противовирусная			Иммуно-модулирующая
Локализация генов	9 хромосома	2 и 5 хромосомы		11 хромосома

Инфицирование клетки вирусом вызывает синтез лейкоцитарного интерферона. Под действием интерферонов активируются защитные механизмы соседних клеток, обеспечивая их устойчивость к вирусной инфекции. Активация затрагивает гены ряда белков, в том числе двух, обладающих прямой антивирусной активностью. Это протеинкиназа, которая фосфорилирует субъединицу инициирующего трансляцию фактора eIF-2 и тем самым инактивирует его, блокируя в результате синтез вирусных белков, и другой фермент – 2',5'-олигоаденилат-синтетаза, активирующая латентную в обычных условиях эндонуклеазу, способную разрушать вирусные РНК.

Гамма-ИФН, как и другие типы интерферонов, ингибирует размножение вируса в клетках, но, кроме того, усиливает специфический иммунный ответ, стимулируя повышенную экспрессию молекул МНС класса I и II, а также сильно активируя макрофаги и НК-клетки. О важном значении интерферонов в поддержании противовирусной резистентности организма в целом свидетельствует повышенная восприимчивость к вирусным инфекциям у мышей после введения им антител против интерферонов.

2. Изучить схему противовирусного иммунитета (зарисовать схему 1, оформить протокол).

Отличие противовирусного иммунитета от других видов иммунитета (против бактерий, простейших, грибков и т.д.) связано со своеобразием структуры и размножения вирусов, особенностями патогенеза вирусных инфекций. Видовой противовирусный иммунитет обусловлен отсутствием у клеток данного вида организмов рецепторов для прикрепления (адсорбции) соответствующих вирусов или их неспособностью репродуцироваться после проникновения в клетку, наличием неспецифических ингибиторов и нуклеаз в сыворотке крови, множеством других факторов.

Уровень специфической и неспецифической резистентности помимо возможных врожденных дефектов определяется множеством других факторов (возраст, стрессы, питание, суточный биоритм, время года и т.д.). Нормальные киллеры лизируют клетки организма, инфицированные вирусами. Активные НК-клетки появляются уже через двое суток после заражения организма-хозяина вирусом. Они служат главным эффекторным механизмом сопротивления герпесвирусной, в частности, цитомегаловирусной инфекции. При отсутствии или уменьшении их активности, например, у больных с синдромом Чедиака-Хигаши наблюдается повышенная восприимчивость к вирусу цитомегалии.

Так, термолабильные сывороточные β-ингибиторы (липопротеины) обладают инактивирующим действием против широкого круга вирусов. Уровень содержания в сыворотке этих ингибиторов взаимосвязан с резистентностью организма к вирусному заражению. У новорожденных и детей первого года жизни он низок, чем в известной степени объясняется восприимчивость к вирусам. Та же закономерность характерна для интерферонов – важнейших факторов неспецифической резистентности.

Немаловажную роль в защите от вирусов играет воспалительная реакция, направленная на ограничение распространения вирусов в организме и фиксацию их в воротах инфекции. При этом помимо клеток крови (макрофагов, естественных киллеров) противовирусный эффект оказывают такие универсальные реакции на внедрение вирусов, как общее или локальное повышение температуры и увеличение кислотности среды. Ранняя стадия инфекции, как правило, состоит в противоборстве вируса с защитными системами организма-хозяина. Самый первый защитный барьер – это препятствующие внедрению вирусов кожные покровы и слизистые оболочки организма. В случае нарушения их целостности в действие вступают механизмы экстренной неспецифической защиты – интерфероны, НК-клетки и макрофаги.

Специфический противовирусный иммунитета развивается с участием Т- и В-клеток. При отсутствии Т-клеток организм-хозяин весьма восприимчив к атакам вирусов. Антитела и комплемент способны ограничить распространение вируса и предотвратить повторную инфекцию. Антитела могут нейтрализовать инфекционность вирусов. Если вирусу удается преодолеть барьеры врожденного иммунитета, он вызывает развитие адаптивного иммунного ответа с появлением цитотоксических Т-клеток, хелперных Т-клеток и противовирусных антител. Антитела служат главным препятствием для распространения вируса в другие клетки и ткани, особенно для проникновения его в кровоток. В лимфоидной ткани слизистых оболочек образуются преимущественно антитела класса IgA, предотвращающие повторную инфекцию. Антитела могут быть направлены против любого вирусного антигена, синтезируемого в инфицированной клетке, однако сдерживание инфекции обеспечивают только те из антител, которые специфичны к гликопротеинам, экспрессированным на оболочке вирусов или на мембране инфицированных клеток. Механизмы гуморального противовирусного иммунитета могут быть различными. Так, способ устранения вирусных частиц зависит от их локализации – внеклеточной или внутриклеточной. О действии in vivo защитных механизмов свидетельствует то, что инъекция моноклональных вирус-нейтрализующих антител весьма эффективно угнетает репродукцию вирусов. Присутствие в кровотоке нейтрализующих вирус антител – это и важный фактор предотвращения повторной инфекции. Комплемент участвует в нейтрализации внеклеточных вирусов некоторых видов. Комплемент также способен повреждать оболочку вируса – осуществлять виролиз. Некоторые вирусы непосредственно вызывают активацию комплемента по классическому или альтернативному пути.

Схема 1