Иммунопатогенез ревматоидного артрита

В составе иммунных комплексов определяется IgM, комплемент и альфа-2-макроглобулин. В сыворотке крови чаще обнаруживаются мелкие ИК, слабо активирующие комплемент, а в синовиальной жидкости – крупные, хорошо активирующие. Мелкие иммунные комплексы могут определять в организме развитие ситуа­ций, свойственных сывороточной болезни. При РА они обусловлива­ют развитие артериита, реже – полисерозита и, вероятно, легочных осложнений. Отложения их удается обнаружить в стенках сосудов. Иммунные комплексы, формируемые в синовиальной жидкости из IgG и РФ, активируют комплемент и поглощаются фагоцитами синови­альной жидкости и синовиальной оболочки – А-клетками.

Таблица 14

Лабораторные признаки ра и скв

Признаки	РА	СКВ
Частота ревматоидного фактора	положительный у 70%	положительный у 30 %
титры ревматоидного фактора	Высокие	низкие
Антинуклеарные антитела:
класс	IgМ	IgG
титры	Низкие	высокие
частота выявления	40 %	95 %
Анти-ДНК-антитела частота выявления у больных	< 10 %	70-85 %
Уровень С3 и С4 компонентов комплемента	Нормальный или повышенный	Пониженный или нормальный
С-реактивный белок	Повышен	Нормальный
Реакция Вассермана	Отрицательная	Может быть положительной
Уровень IgG в сыворотке крови	Обычно нормальный	Часто повышенный

Эти клетки после фагоцитоза содержат значительное количество включений ок­руглой формы и напоминают тутовые ягоды – Ra-клетки – рагоциты.

В лечении таких больных чаще всего используются радикальные методы: удаление зубов, протезирование съёмными протезами. В последние годы медицина достигла больших возможностей, не исключается рациональное несъёмное протезирование, вплоть до имплантации, когда пациент может восстановить зубы, так же, как и абсолютно здоровый человек, лишь при одном условии: строго соблюдать правила личной гигиены.

2. Изучить метод определения ревматоидного фактора (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Принцип метода. Основан на реакции агглютинации между ревматоидным фактором (РФ) образца пациента или контрольной сывороткой и человеческим IgG, находящимся на полистироловых латексных частицах. IgG + AT к IgG —► агглютинация.

Схема 21

а б

Схематическое изображение нормального сустава (а)

И измененного в результате ревматоидного артрита (б)

Исследование латекс-теста позволяет сделать полуколичест­венное определение ряда иммунопатологических показате­лей (например, ревматоидного фактора и др.) в неразбавленной сыворотке методом агглютинации латексных частиц. Метод удобен в исполне­нии, экономически выгоден, время анализа – 2–3 мин. В на­боре имеются положительный и отрицательный контроли. Определение ревматоидного фактора играет важную роль в диагностике ревматоидного артрита, при котором наблюда­ются значительные нарушения иммунной системы. Они обу­словлены неполноценным иммунным ответом с образовани­ем иммунных комплексов. В формировании последних ос­новную роль играет РФ, который представляет собой, в ос­новном, AT IgM, направленный против IgG.

Техника постановки анализа: перед постановкой реакции сыворотку пациента и набор выдержать в течение 30 мин. при комнатной температуре.

Пипетировать на слайд-стекло в отдельные лунки:

- сыворотку пациентов – 40 мкл;

- положительный контроль – 40 мкл;

- отрицательный контроль - 40 мкл;

- добавить в каждую лунку по 40 мкл латексного реагента;

- осторожно перемешать содержимое лунок стеклянной па­лочкой;

- результаты учесть через 2–3 мин.

Учет результатов:

- анализ образцов пациентов проводить после получения результатов отрицательного и положительного контро­лей;

- отсутствие агглютинации в сыворотке указывает на от­сутствие РФ;

- при положительной реакции (четкая агглютинация) сле­дует провести титрование сыворогок буферным раство­ром в различных соотношениях: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 и т.д.;

- отрицательным будет результат, содержащий в образце РФ менее 20 МЕ/мл;

- положительный результат (четкая агглютинация) указы­вает на количественное содержание РФ в сыворотке па­циента.

Титр разведения (сыворотка + буферный р - р)	РФ в МЕ/мл (условно)
1+1 (1:1)	24
1+3 (1:4)	48
1+7 (1:8)	96
1+15 (1:16)	192
1+31 (1:32)	384
	и т.д

Примечание: 1+1 —> 40 мкл сыворотки + 40 мкл буферного раствора

Контроль качества:

- отрицательный контроль – отсутствие агглютинации в лунке;

- положительный контроль – четкая агглютинация в лунке слайд-стекла.

Стандартизация метода:

- использование чистых слайд-стекол для проведения латекс-реакции;

- использование чистых стеклянных палочек для смешива­ния реагентов;

- использование точных дозированных пипеток;

- строгое соблюдение времени проведения реакции, ука­занного в инструкции;

- использование правильного освещения для учета резуль­татов агглютинации;

- правильное разведение используемых реагентов;

- обязательное использование отрицательных и положи­тельных контролей при постановке реакции;

- строгое соблюдение условий хранения реагентов.

Преимущество метода:

- скрининг-тест;

- возможность широкого использования.

Недостаток метода: визуальная оценка результа­тов

5. Изучить реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Изучение антигенспецифической активации лимфоцита – эффектов гиперчувствительности замедленного типа – позволяет проконтролировать спонтанную подвижность фа­гоцитов, циркуляцию, накопление фагоцитов в зоне воспале­ния и мобилизацию защитных свойств этих клеток in vivo.

PTMЛ периферической крови играет важную роль для оцен­ки специфического клеточного иммунитета при различных заболева-ниях.

Принцип метода. В присутствии специфического ан­тигена предварительно сенсибилизированные лимфоциты выде ляют фактор (лимфокин), тормозящий миграцию лейко­цитов.

В реакциях могут использоваться лейкоцитарная сус­пензия (по Бейому) и капиллярная кровь.

Техника постановки анализа:

- в лунки плоскодонного планшета внести по 200 мкл культуральной среды (контроль) и по 200 мкл раствора митогена (ФГА);

- в пробирку с гепарином (20 ЕД гепарина/мл крови) взять кровь из пальца или из вены;

- через 30–40 мин собрать лейковзвесь в чистую центри­фужную пробирку; довести объем лейковзвеси ФСБ до 10 мл и отцентрифугировать 7–10 мин при 1000 об/мин;

- супернатант удалить, а осадок тщательно ресуспендиро­вать в объеме в 2–3 раза меньше исходного;

- установить аппаратик для РТМЛ на плоскодонный план­шет. Взять чистые наконечники и пипетку на 5 мкл. Бы­стро наполнить наконечники лейковзвесью и аккуратно вставить в лунки планшета, заполненные культуральной средой и различными концентрациями аутоантигена;

- планшет, установленный на горизонтальном столике, ин­кубировать 1 ч;

- после инкубации снять аппаратик, закрыть планшет крышкой и поместить в инкубатор (при 37°С атмосфера СО₂) на ночь.

Учет реакции проводить на следующий день с по­мощью микроскопа. Измерить диаметр миграции в контроле и в опытных образцах.

Подсчитать индекс миграции (ИМ) для используемых концентраций аутоантигенов:

ИМ= Д²опыт

Д²контр.

Индекс миграции <0,85 и >1,15 указывает на сенсиби­лизацию Т-лимфоцитов. По индексу миграции лимфоцитов можно выбрать дозы аутоантигенов, на которые реагируют только лимфоциты пациентов. Учет РТМЛ позволяет прово­дить скрининговые исследования на аутоиммунную патоло­гию.

Можно использовать другой метод определения РТМЛ.

3. Изучить постановку РТМЛ капиллярным методом (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Наибо­лее распространен в клинической иммунологии капиллярный вариант РТМЛ.

Постановка опыта. Капилляры определенного диа­метра плотно заполняют лейкоцитами крови, вводя в них суспензии клеток с последующим центрифугированием. Ан­тигены (бактерии, вирусы, грибы и др.) добавляют к суспен­зии клеток или в среду инкубационных камер. Капилляры помещают в камеры, содержащие среду 199, и инкубируют 18–24 ч при t = 37°С. За это время лейкоциты мигрируют из капилляра, образуя зону помутнения. При наличии сенсиби­лизации к антигену лимфоциты синтезируют фактор, тормо­зящий миграцию лейкоцитов. Измеряют площадь этой зоны.

Учет реакции проводится по величине площади миграции в опыте и в контроле (без антигена). Реакция может прово­диться в слое агарозы. Индекс миграции (процент миграции) рассчитывается по формуле: ср. площадь миграции лим­фоцитов с антигеном / ср. площадь миграции без антиге­на х 100, выражается в процентах. Положительной считается проба с индексом миграции менее 80%. Чем выше сенсиби­лизация, тем больше торможение миграции, и, соответствен­но, ниже процент индекса миграции. Торможение миграции более 20% считается положительным.

Метод позволяет без кожных проб определить сенси­билизацию лимфоцитов человека к различным аллергенам и антигенам.

2. Подведение итогов занятия – 5 мин.

Практическое занятие 9

Тема. Иммунологическая толерантность. Центральная и перифери-ческая толерантность. Индукция толерантности в неонатальном и взрослом периодах жизни. Адоптивный период в индукции толерантности. Особенности индукции толерантности, значение дозы антигена. Механизмы формирования толерантности к «своему». Понятие об анергии, делеции, супрессии, игнорировании. Роль Т- и В-лимфоцитов, генетических факторов в развитии толерантности.

Аутоиммунные состоя­ния. Аутоиммунитет. Аутоиммунные заболевания.

Цель занятия. Ознакомить с понятием толерантность, механизмами развития. Ознакомить с понятиями аутоиммунитет, аутоиммунные состоя­ния и заболевания.