Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 2 академических часа (90 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме: «Гиперчувствитель- ность немедленного типа. Аллергическая реакция I типа».

1. Классификации аллергенов

2. Понятие сенсибилизации

3. Понятие гиперчувствительности немедленного типа (В-зависимая аллергия)

4. Стадии ГНТ первого типа

5. Механизм синтеза IgE

6. Строение IgE

7. Принцип метода ИФА по определению специфических IgE

4. Выполнение практической работы – 30 мин

Практическая работа

1. Изучить классификацию аллергенов (записать в тетрадь, оформить протокол) (таблица 8)

Таблица 8

Классификация аллергенов по происхождению

(Б.Н. Райскис и соавт.)

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ	Г РИБКОВЫЕ
		ВИРУСНЫЕ
Г ЕЛЬМИНТНЫЕ
	И НФЕКЦИОННЫЕ	ПРОТОЗОЙНЫЕ
П ЫЛЬЦЕВЫЕ		БЫТОВЫЕ
	Н ЕИНФЕКЦИОННЫЕ
ЭПИДЕРМАЛЬНЫЕ		НАСЕКОМЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ		ПРОМЫШЛЕННЫЕ
	ПИЩЕВЫЕ

2. Изучить схему образования IgE (записать в тетрадь схему 12, оформить протокол)

3. Изучить схему строения IgE (зарисовать, рис.2).

Рис. 2. Строение IgE

Схема 12

Механизм образования IgE

Схема 13

Анафилактический тип реакции

4. Изучить механизм развития I типа гиперчувствительности по схемам 13 и 14 (зарисовать)

Анафилактические реакции специфичны и развиваются после попадания аллергена, к которому организм был предварительно сенсибилизирован. После первичного контакта с аллергеном такое состояние формируется через 7–14 сут и сохраняется годами.

Реакции гиперчувствительности I типа – анафилактический тип – обусловлены взаимодействием аллергена и IgE, сорбированным на мембранах тучных клеток и базофилов, что приводит высвобождению БАВ (гистамин, серотонин, эозинофильный и нейтрофильный хемотаксические факторы, протеазы).

БАВ взаимодействуют с рецепторами мышечных клеток, секреторных и многих других клеток, что приводит к сокращению гладкой мускулатуры (например, бронхов), повышению проницаемости сосудов и отеку.

Клинически реакции первого типа проявляются анафилаксией (системные реакции) и атопическими заболеваниями (местные реакции), реже острой крапивницей и ангионевротическим отеком. Главные формы: риниты, конъюнктивиты, бронхиальная астма, отек Квинке.

Схема 14

А ЛЛЕРГЕН + IgE
КЛЕТКИ-МИШЕНИ ПЕРВОГО ПОРЯДКА: Т УЧНАЯ КЛЕТКА, БАЗОФИЛ, ЛИМФОЦИТ, ТРОМБОЦИТ
В ЫБРОС МЕДИАТРОВ
КЛЕТКИ-МИШЕНИ ВТОРОГО ПОРЯДКА КЛЕТКИ ГЛАДКИХ МЫШЦ, СОСУДОВ, БРОНХОВ, МИОКАРДА, МИОМЕТРИЯ ЭКЗОКРИННЫХ ЖЕЛЕЗ
МЕСТНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ	СИСТЕМНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ
гиперемия отек крапивница некроз гиперсаливация	шок бронхоспазм ДВС-синдром активация миометрия, кишечника

Схема развития истинной анафилактической реакции

5. Изучить схему развития анафилактоидной реакции (зарисовать, оформить протокол) (схема 15)

Схема 15

Ренгенконтрастные средства Декстраны Гамма-глобулин Местные анастетики Миорелаксанты 1 О пиаты (морфин) Протамина сульфат Барбитураты и др.	Прямое высвобождение медиатров Каскад арахидоновой кислоты Активация лимфоцитов Цитотоксический эффект Активация комплемента Возбуждение вегетативных рецепторов А ктивация кининовой системы
2 Клетки-мишени первого порядка: ТУЧНАЯ КЛЕТКА, БАЗОФИЛ, ЛИМФОЦИТ, ТРОМБОЦИТ 3
Выброс медиаторов
4 КЛЕТКИ-МИШЕНИ ВТОРОГО ПОРЯДКА КЛЕТКИ ГЛАДКИХ МЫШЦ СОСУДОВ, БРОНХОВ, МИОКАРДА, МИОМЕТРИЯ, ЭКЗОКРИННЫХ ЖЕЛЕЗ
Местные проявления гиперемия отек крапивница некроз гиперсаливация	Системные проявления шок бронхоспазм ДВС-синдром активация миометрия, кишечника

Схема развития анафилактоидной реакции

6. Изучить метод определения общего иммуноглобулина Е в сыворотках крови (составить алгоритм метода, записать в тетрадь, оформить протокол)

Количественное определение уровня общего IgE (МЕ/мл) в сыворотке, плазме крови или других биологических жидко­стях человека важно при исследовании гуморального имму­нитета, диагностике иммунодефицитов, паразитарных забо­леваний, парапротеинемий и, особенно, при аллергических заболеваниях.

Клетки, «вооруженные» IgE-антителом – тучные клет­ки тканей и базофилы крови, реагируют на «свой» антиген сильнее и быстрее, чем макрофаги и гранулоциты, несущие аналогичные IgE-антитела.

Система IgE имеет особую регуляцию, мало связан­ную с регуляцией синтеза остальных иммуноглобулинов. Это позволяет использовать определение общего IgE для диффе­ренциального диагноза, прогноза и контроля терапии в тех случаях, когда определение других иммуноглобулинов мало или неинформативно.

Известны несколько методов определения общего IgE: конкурентный радиоиммунный, иммунорадиометрический с последовательным связыванием двух антител (сэн­двич-тест), сэндвич-тесты на основе моно- и поликлональных антител к IgE, упрощенная модификация ИФА (латекс-тест, иммунохроматография). Наибольшее распространение полу­чил метод ИФА.

Техника постановки анализа:

- в соответствующие лунки планшета внести в дублях ка­либраторы, контрольную сыворотку и исследуемые про­бы по 20 мкл. В лунки А1 и В1 внести калибратор «О» - эти лунки являются бланком;

- внести сразу во все лунки по 100 мкл конъюгата;

- перемешать на шейкере в течение 20-30 с ,закрыть план­шет пленкой и инкубировать в термостате при 37 С 1,5 ч;

- после инкубации промыть планшет четыре раза промы­вающим ра-створом по 200 мкл. Стряхнуть остатки рас­твора на фильтровальную бумагу;

- внести во все лунки по 150 мкл проявляющего раствора и инкуби-ровать в термостате при 37°С 15 мин.;

- внести в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента;

- измерить на мультискане при 450 нм оптическую плот­ность вне-сенных проб.

7. Изучить метод определения специфического иммуноглобу-лина Е в сыворотке крови (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол)

При аллергопатологии тучные клетки, базофилы, несущие рецепторы IgE, при повторной встрече с антигеном (ал­лергеном) образуют на своей поверхности иммунный комплекс «АГ+IgE». В результате происходит актива­ция тучных клеток с выбросом огромного количества биологически активных веществ (медиаторов) с дегрануляцией тучных клеток, оказывающих повреждающее дей­ствие на клетку. Измерение общего IgE в сыворотке крови не может слу­жить единственным и главным показателем в дифферен­циальной диагностике аллергических и неаллергических заболеваний со сходной симптоматикой и локализацией. Только обнаружение диагностически значимых концен­траций специфических IgE антител указывает на возмож­ное участие аллергии немедленного типа в патогенезе за­болевания. Существуют различные тест-системы (ИФА, радиоим­мунный, иммуннохемилюминесцентный) для определе­ния специфических IgE к аллергенам. Остановимся на одном из них - «Иммунодоте ИФА».

Принцип метода – твердофазный двустадийный ИФА. Пять аллергенов (пищевые, пыльцевые, бытовые или грибковые), а также контроли (положительный, отрицатель­ный) нанесены в виде точек на полистироловую поверхность индикаторной полоски. При первой инкубации IgE антитела сыворотки связываются с соответствующими аллергенами. Не связавшиеся компоненты отмываются. При второй инку­бации к связавшимся молекулам IgE присоединяются анти-IgE-мышиные моноклональные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Связавшийся фермент после промывки вы­являют с помощью цветной реакции с хромогеном. Интен­сивность окраски аллергена прямо пропорциональна содер­жанию специфических IgE-антител к данному аллергену.

Оценка визуальная в соответствии с классами RAST (от 0-го до 4-го класса) по карточке интерпретации окраски (табл.9).

Техника постановки анализа:

- соответствующие индикаторные полоски с пищевыми, пыльцевыми, эпидермальными, бытовыми или грибко­выми аллергенами вставить в инкубационную камеру;

промаркировать;

1-я инкубация:

- внести 1,0 мл неразведенной анализируемой сыворотки в отделе-ние камеры с соответствующей полоской. Накрыть инкубационную камеру и инкубировать 2 ч при комнат­ной температуре при постоян-ном встряхивании на шейкере;

- если объем анализируемого образца меньше 1,0 мл, пробу можно развести физиологическим или промывочным рас­творами не более чем в 5 раз и инкубировать в течение ночи;

- после инкубации слить содержимое лунок, внести в ка­меры по 1,5 мл промывочного раствора и инкубировать 5 мин. При комнатной температуре при постоянном встряхивании. Процедуру промывки повторить еще 2 раза;

2-я инкубация:

- внести 1,0 мл раствора конъюгата в отделения камеры;

- закрыть инкубационную камеру и инкубировать 1 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании на шейкере;

- после инкубации провести промывку 3 раза;

проявление:

- внести по 1,0 мл проявляющего раствора в отделения ка­меры и инкубировать не менее 15 мин при комнатной температуре при постоянном встряхивании;

- после инкубации содержимое лунок слить и внести в ка­меры по 1,5 мл дистиллированной воды.

Учет результатов:

- вынуть полоски из камеры, промокнуть фильтровальной бумагой и просушить не менее 30 мин;

- оценка результатов визуальная, путем сравнения резуль­татов интенсивности окраски с цветовой шкалой на кар­точке интерпре-тации окраски. Приблизительное соответ­ствие класса RAST содер-жанию специфических IgE анти­тел следующее:

Таблица 9

Класс RAST	IgE антитела МЕ/мл	Интерпретация
0	<0,35	Отсутствие или присутствие очень низкого количества специфических IgE
1	0,35-0,70	Присутствие низкого количества специфи­ческих IgE
2	0,71-3,50	Присутствие среднего количества специ­фических IgE-антител
3	3,51-17,5	Присутствие значительного количества специфических IgE-антител
4	>17,5	Присутствие очень большого количества специфических IgE-антител

Тест-система позволяет определить сенсибилизацию к пищевым, пыльцевым, бытовым, эпидермальным или гриб­ковым антигенам-аллергенам.

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

Практическое занятие 5

Тема. Аллергическая реакция I типа (продолжение). Иммунопатогенез: атопии, крапивницы, отека Квинке, анафилактического шока, атопической бронхиальной астмы. Диагностика. Принципы лечения. Классификация антигистаминных препаратов.

Цель занятия. Освоить иммунные механизмы, клинические проявления заболеваний, развивающихся по гиперчувствительности I типа. Ознакомить с методами диагностики. Ознакомить с классификацией антигистаминных препаратов