Напрями та методи досліджень

“2.1”.Матеріали і методи досліджень

Дослідження проводилось в лабораторії кафедри епізоотології та організації ветеринарної справи,в неблагополучному господарстві,ПОП ім.-Войкова ,смт Михайло-Коцюбинське ,Чернігівської області та в Чернігігівській реґіонарній державній лабораторії ветеринарної медицини.

Визначення кількісного та якісного складу мікрофлори фекалій умовно здорових новонароджених телят та телят з шлунково-кишковими розладами.

Експериментальні дослідження проводили на базі ПОП “ім.-Войкова”. Проби фекалій від новонароджених телят відбирали в стерильні, попередньо зважені, бактеріологічні пробірки, починаючи з першої доби від народження і кожної наступної доби протягом 5-ти діб життя. Досліджуваний матеріал (без консервантів) в термосі з льодом протягом 2 годин доставляли в державну реґіонарну лабораторію Чернігівської області для подальшого дослідження. Досліджуваний матеріал (проби фекалій) суспензували в ізотонічному розчині натрію хлориду (pH=7,1-7,2) у відношенні 1:10 (з розрахунку 1г фекалій і 9мл NaCl) і висівали на поживні середовища: Плоскирєва, ВСА (вісьмут-сульфіт агар) і Ендо. Наступні дослідження проводили за схемою, показаною на рис.2.1.

Для кількісної характеристики аеробної мікрофлори проводили дозований посів на щільні середовища із трьох діагностично значимих розведень вихідного матеріалу (10^-3; 10^-5; 10^-7). Розведення готували в п’яти бактеріологічних пробірках. В три пробірки наливали по 9,9 мл ізотонічного розчину хлориду натрію ( для розведень 10^-3; 10^-5; 10^-7), в дві пробірки 9,0 мл (для розведень 10^-8 і 10^-9) і послідовно переносили суміш з попереднього

“Рис” .2.1. Схема посіву фекалій.

Розведення в наступне в об’ємах, (0,1мл і 1,0 мл). На кожне наступне розведення брали нову стерильну піпетку і суміш добре перемішували (суспензували). Перед роботою щільні середовища підсушували в термостаті при t=37^oC протягом 1 години до зникнення конденсаційної вологи.

Для виділення патогенних і умовно-патогенних ентеробактерій використовували такі середовища:

-селенітовий бульйон – рідке середовище для накопичення сальмонел;

-селективне середовище Плоскирєва для виділення шигел і сальмонел (посів робили із розведення 1:10 бактеріологічною петлею), культивували в термостаті при t=37^oC протягом 18-24 годин;

-ВСА (вісмут сульфіт агар) – це виключно селективне середовище для виділення сальмонел. Посів проводили бактеріологічною петлею із розведення 1:10 (10^-1), розтерали шпателем і культивували в термостаті при t=37^oC протягом 18-24 годин та з селенітового середовища (після термостатування 18-24 години);

- диференціально-діагностичне середовище Ендо для виділення ентеробактерій. Посів проводили петлею з розведення 1:10 (10^-1) піпеткою з розведення 10^-5 і 10^-7 в об’ємі 0,1мл з наступним розтеранням шпателем, культивуванням в термостаті при t=37^oC протягом 18-24 годин;

- ЖСА (жовтково-сольовий агар) – середовище для виділення стафілококів. Посів проводили стерильною піпеткою із розведення 10^-3 в об’ємі 0,1мл з наступним розтеранням шпателем і культивуванням в термостаті при t=37^oC протягом 48 годин;

- середовище Сабуро для культивування грибів та дріжджів Посів на чашку Петрі проводили піпеткою із розведення 10^-3 в об’ємі 0,1 мл з наступним розтеранням шпателем, культивували в термостаті при t=24^oC п’ять діб.

-середовище Сімонса – для диференціації ентеробактерій за їх властивістю використовувати цитрат натрію як єдине джерело вуглецю, тобто, для диференціації E.coli (Сім-) від інших умовно патогенних (Сім+). Посів на чашку Петрі проводили стерильною піпеткою із розведення 10^-5 в об’ємі 0,1мл з наступним розтеранням шпателем і культивуванням в термостаті при t=37^oC протягом 24 годин;

-5% кров’яний агар для виділення гемолітичних форм мікроорганізмів (коки, ентеробактерії). Посів проводили піпеткою на чашку Петрі із розведення в 10^-5 об’ємі 0,05мл з послідуючим розтеранням шпателем, культивували в термостаті при t=37^oC протягом 24 годин.

Для виділення лакто- і біфідобактерій використовували середовища:

-середовище Блаурокка для культивування біфідобактерій (придонний посів робили з розведення 10^-7, 10^-8, 10^-9 в об’ємі 1мл, культивували в термостаті при t=37^oC відповідно 48-72 години;

-середовище Блікфельдта для виділення лактобактерій- посів проводили із розведення 10^-5, 10^-7 в об’ємі 0,1мл в анаеробних умовах протягом 48-72 годин.

Морфологічні ознаки виділених культур визначали методом фарбування за Грамом з подальшою мікроскопією їх.

При посіві матеріалу на щільні поживні середовища враховували кількість колоній, розмір ізольованих колоній (діаметр в мм), форму (плоска, випукла), особливості країв (рівні-S-форма, хвилясті-R-форма), поверхні (блискуча, матова), колір, щільність (прозора, мутна) і консистенцію.

Для кількісної характеристики вирощених умовно-патогенних мікроорганізмів підраховували колонії кожного виду на диференційно-селективних середовищах (Ендо, ЖСА, Плоскирєва, Блікфельдта).

Кількість ентеробактерій в 1г фекалій визначали таким чином: кількість вирощених колоній множили на відповідне розведення (із якого робили посів на чашку Петрі) і на 20, якщо висівали 0,05мл або на 10, якщо висівали 0,1мл.

Відібрані для подальшого вивчення колонії пересівали для первинної ідентифікації на середовище Олькеницького, на якому поряд з отриманням культури визначали одночасно декілька ознак: властивість культури утворювати сірководень, її відношення до глюкози, лактози, сахарози і сечовини . Висівали колонії на середовище Олькеницького бактеріологічною голкою спочатку по скошеному агару штрихом, а потім уколом в товщу агарового стовпчика. Посіви інкубували при t=37^oC протягом 18-24 годин.

При ферментації лактози (сахарози) змінюється колір середовища в скошеній частині, при ферментації глюкози в стовпчику під час газоутворення з’являються пухирці повітря. Утворення сірководню визначали по почорнінню середовища. При рості культури, що гідролізує сечовину, проходить залужування, в результаті якого все середовище набуває малинового кольору. На підставі біохімічних властивостей, можна зробити попереднє припущення щодо родової належності культури.

Для уточнення родової, а інколи і видової належності виділених культур ми користувалися мінімальним диференційованим рядом -строкатий ряд (рис. 2.2).

“Рис”. 2.2. Набір середовищ (мінімальний диференційний ряд) для визначення біохімічних властивостей мікроорганізмів.

Для повної видової ідентифікації в випадках користувалися додатковими біохімічними тестами враховуючи тінкторіальні, морфологічні та культуральні властивості.

E.coli H.alvei Klaebsiella Serratia * P.alcalifaciens P.stuartii E.dvardsiella (kp.E.tarda)	E.coli H.alvei Klaebsiella * Serratia * C.diversus C.amalonaticus P.alcalifaciens P.stuartii E.dvardsiella (kp.E.tarda)	E.coli E.agglomerans Serratia *	E.coli H.alvei Klaebsiella * Enterobacter * Serratia * C.diversus C.amalonaticus C.freundii Klugvera *	Salmonella * C.freundii E.tarda	S.gallinarum S.pullorum	C.freundii S.arisona	P.vulgaris P.mirabilis	Mmorganii P.rettgeri P.myxofaciens

Примітка - * -більшість представників роду

Умовні позначення:

- червоний колір (відсутність ферментації лактози і сахарози)

- жовтий колір (наявність ферментації глюкози і (або) лактози до кислоти

- жовтий колір з розривами в середовищі (ферментація глюкози до кислоти та газу)

- чорний колір (утворення сірководню)

“Рис. 2.2”. Первинна ідентифікація ентеробактерій за допомогою біохімічних реакцій на середовищі Олькеницького

Облік результатів проводили візуально з допомогою таблиці кольорових показників.

Біохімічні дослідження крові телят

Дослідження проводили на базі бактеріологічної лабораторії міста Чернігова

Для проведення біохімічних досліджень кров відбирали: від п’яти щойно народжених телят (18-24год. після народження); від п’яти телят з розвинутим розладом кишечника (3-5-та доба після народження); від п’яти телят, яким було проведено корекцію шлунково-кишкових розладів за допомогою “Бактонорму”.

Кров відбирали з яремної вени в стерильні пронумеровані пробірки по 10-15мл. Сироватку отримували методом згущування та відстою. Для кращого звертання та відстоювання сироватки пробірки з кров’ю витримували 30-40хв. у теплій воді (30^оС). Згусток крові відділяли від стінок пробірки стерильною голкою для ін’єкцій, після чого проби витримували в побутовому холодильнику 20-24 години. Відстояну сироватку використовували для проведення біохімічних досліджень.