21. Опишите фосфоинозитид-зависимую сигнальную систему.

22.Через какие каналы кальций входит в цитоплазму из внеклеточной среды? Опишите группы каналов и их регуляцию.

1 .Потенциал-открываемые кальциевые каналы (voltage operated Са2+ channels – VOCC) выявляются, в основном, в возбудимых клетках. Они открывают мощный ток кальция в цитоплазму в ответ на деполяризацию мембраны и контролируют быстрые клеточные процессы, такие как мышечное сокращение и экзоцитоз везикул на пресинаптических окончаниях нейронов. Их чувствительность регулируется аденилатциклазной сигнальной системой.

2 .Рецептор-открываемых кальциевых каналов (receptor operated Са2+ channels – ROCC). Входит в группу LOCC (лиганд-открываемые кальциевые каналы)Целая группа кальциевых каналов открывается в результате действия внеклеточных первичных посредников. Например, NMDA (N-methyl-D-aspartate) Рецепторы являются кальциевыми каналами, открываемыми в ответ на действие глутамата, или адениновыми нуклеотидами(Р2-пуриноРецепторы).

Условиями открытия канала являются связывание глутамата с рецептором и деполяризация мембраны, приводящая к удалению Mg2+, который является блокатором канала. Это достигается совместным действием двух агонистов - нейротрансмиттеров, один деполяризует клетку и готовит ее к взаимодействию с глутаматом.Glu может делать и то и другое сам, активируя вначале АМРА Рецепторы, обеспечивающие деполяризацию постсинаптической клетки.

3.(SMOC - second messenger operated Са2+ channels )открывается в результате действия вторичных посредников. В качестве могут выступать инозитол-1,4,5-трисфосфат,инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфат,ионы Са2+ и циклические нуклеотиды (cGMP и cAMP). Данные о влиянии продуктов фосфоинозитидного метаболизма на ионную проницаемость плазматической мембраны очень фрагментарны. Из активируемых вторичными посредниками проводящих Са2+ каналов лучше всего исследованы cGMP/cAMPчувствительные каналы. Они представляют собой низкоселективные катионные каналы, активируемые циклическими нуклеотидами с внутренней стороны мембраны. Впервые эти каналы были обнаружены в палочках сетчатки (Fesenko et al., 1985), а затем их существование было показано в колбочках сетчатки (Nakamura & Gold, 1987). В фоторецепторных клетках эти каналы активируются под действием cGMP. Они открываются при непосредственном связывании с ними циклических нуклеотидов - cGMP (фотоРецепторы) и cAMP/cGMP (обонятельные нейроны), без участия протеинкиназ.

4.transient receptor protein (TRP)-

ионные каналы. Эти каналы имеют низкую проводимость к ионам, поэтому могут в течение долгого времени находиться в открытом состоянии без существенного влияния на уровень кальция в цитоплазме. Однако эти каналы, наряду с кальциевыми буферами, играют важную роль в тонкой настройке кальциевой сигнализации. Они регулируют базовый уровень кальция в ц.п. и пополнение запаса кальция в ЭПР. Не совсем понятен механизм. Кто знает-пишите.

23. Опишите сигнальные каскады, активируемые факторами роста и регулирующие пролиферацию клеток.

Факторы роста: гормоны прогрессии (не действуют на клетку в фазе G0, ускоряют переход в митоз уже делящейся клетки в фазе G1) и гормоны компетенции (переход клетки из G0 в G1, что дает ей возможность отвечать на гормоны прогрессии).

Типы факторов роста: цитокины (Гематопоэтические факторы роста – плейотропная активность, не накапливаются, синтезируются многими клетками), классические факторы роста (VEGF, PDGF, FGF, EGF).

Рецепторы факторов роста поэтапно передают сигнал в клетки, взаимодействуя со специальными адаптерными белками, которые выполняют функцию промежуточных передатчиков. Некоторые Рецепторы сами являются ферментами (киназами или фосфатазами), передающими сигнал путем прямой ковалентной (посттрансляционной) модификации белков без участия вторичных посредников. При этом адаптерным белком может быть сам активированный рецептор, две объединенные субъединицы которого самофосфорилируют друг друга по остаткам тирозина – например, Рецептор EGF, VEGF и другие GF.

Каскады факторов роста включают: MAP-киназные каскады, цитокиновый каскад с участием JAK/STAT белков, PI3-киназный каскад.

MAP-киназный путь – с участием mitogen-activated protein kinases – часто активируется факторами роста. Обязательные звенья на рисунке. MAP3K – серин/треониновая киназа, а у MAP2K двойная специфичность (фосфорилируют как по тирозину так и по треонину). Активированная MAPK фосфорилирует факторы транскрипции, опосредующие активацию генов, вовлеченных в пролиферацию. Для МАР-каскада, на который влияют факторы роста, характерно наличие на третьем уровне киназы ERK (между тирозином и треонином глутамат*, расшифровка - extracellular signal–regulated kinase1). Характерной особенностью всех МАР-киназных каскадов является высокая специфичность и эффективность передачи сигнала без использования вторичных посредников. Также каскад имеет наивысшую избирательность.

NB! Хронологически более раннее название отражающее способность МАР-киназ фосфорилировать МАР-белок, связанный с микротрубочками (англ., microtubule-associated protein, MAP)

NBB! *Киназы третьего уровня разных МАР-каскадов отличаются аминокислотным остатком между тирозином и треонином, которые составляют консенсусную последовательность и фосфорилируются киназой второго уровня.

Про PI3-каскад. Название от PI3-киназы – фосфорилирует фосфотидилинозитол. Причем в передаче сигналов от рецепторов участвуют PI3-киназы I класса.

Участники PI3-киназного каскада, активируемые факторами роста – Ras белок полноценно активирующий PI3K (последняя заякорена в мембране), фосфатазы PTEN (англ., phosphatase and tensin homolog) и SHIP (англ., Src-homology 2 (SH2)-containing phosphatase) снимают фосфат с PIP3 (причем разный! PTEN – полностью терминирует передачу сигнала, опухолесупрессор, а SHIP не полностью), Akt (или PKB) и PDK1(phosphoinositide-dependent kinase-1, PDK1) за счет своих PH-доменов встречаются вместе рядом с мембраной, что дает возможность PDK1 фосфорилировать Akt. Комплекс PDK1/Akt активирует многие другие факторы (на рисунке) и может опосредовать деление.

Цитокиновый каскад с участием JAK/STAT белков. Отличительной особенностью цитокиновых рецепторов является то, что они не обладают собственной киназной активностью, а для передачи сигнала привлекают из цитозоля растворимые тирозиновые киназы. Последними преимущественно служат тирозиновые Янус-киназы (англ., Janus kinases, JAK, just another). JAK-STAT каскад состоит (JAK) и сигнального белка – трансдуктора и активатора транскрипции (англ., signal transducer and activator of transcription, STAT). Он передает информацию от цитокинов через их Рецепторы непосредственно к промоторам генов-мишеней в ядре без участия вторичных посредников. При этом цитокиновый Рецептор может быть связан и с другими каскадами (MAP, PI3).

Каждая цепь цитокинового рецептора связывает свою JAK-киназу. При активации Рецептор димеризуется, JAK-киназы активируются, фосфорилируют друг друга и специфические тирозиновые остатки в составе рецептора. К последним присоединяется транскрипционный фактор STAT посредством своего SH2-домена. JAK-киназа фосфорилирует и присоединенный к рецептору STAT. После этого STAT диссоциирует от рецептора и формирует димер за счет перекрестного взаимодействия своих SH2-доменов с фосфотирозинами соседней молекулы. В результате образуется димерная форма STAT, в которой С-концевые домены плотно взаимодействуют, а N-концевые свободны для связывания с эффекторными последовательностями. Такой димер перемещается в ядро и запускает экспрессию генов, имеющих соответствующие регуляторные последовательности в их промоторных участках. (укладка цепей в белке STAT чем-то напоминает строение внутриклеточных рецепторов).

Регуляция цитокиновой сигнализации происходит по механизму обратной связи, также характерному для большинства рецепторов. В ней участвуют SOCS-белки (англ., suppressors of cytokine signaling). Они содержат центральный SH2-домен, который обеспечивает связывание SOCS-белка с адаптерным белком или рецептором. Кроме того, они имеют С-концевой гомологичный домен, называемый "SOCS box”. Считается, что эта последовательность направляет SOCS и его партнера в протеасомный путь деградации сигнальных белков. SOCS связываются с рецепторами и/или непосредственно с Янус-киназами, блокируя дальнейшую активацию STAT-белков.

24. PI3-киназная сигнальная система, механизмы включения и выключения этого сигнального каскада.

Свое название PI3-киназа получила согласно своей субстратной специфичности. Этот фермент представляет пример липидно-белковой киназы, способной фосфорилировать и низкомолекулярные липиды, и серин/треониновые аминокислотные остатки в составе белков. Как основной субстрат PI3-киназа использует фосфатидилинозитол (PI) и переносит остаток фосфата с молекулы АТФ в третье положение инозитольного кольца этого фосфолипида. Различные изоформы PI3-киназ фосфорилируют как сам фосфатидилинозитол (PI), так и его фосфопроизводные – монофосфо-PI или бисфосфо-PI. Некоторые исследователи рассматривают эти липидные молекулы как вторичные посредники, которые локализованы в липидном бислое и усиливают сигнал благодаря тому, что образуются в большом количестве в ходе ферментативной реакции.

PI3-киназный сигнальный каскад активируется большинством тирозинкиназных и многими семидоменными рецепторами. Всего известно несколько изоформ PI3-киназ, которые разделяются на три класса, обозначаемых как I, II и III. PI3-киназы класса I являются основными участниками сигнальных каскадов, активируемых поверхностными рецепторами. Они образуют фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфат (PIP₃) из фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PI-4,5-P₂). Ферменты двух других классов фосфорилируют, в основном, фосфатидилинозитол до PI(3)P и функционируют во внутренних компартментах клетки, регулируя трафик эндосом и лизосом. PI3-киназы класса I являются гетеродимерами, в состав которых входит одна из 4-х возможных (α, β, γ и δ) каталитических субъединиц весом 110 кДа и одна из большого набора регуляторных субъединиц.

Общая схема PI3-киназного каскада представлена на рис. 83. С рецепторами связываются регуляторные субъединицы PI3-киназы р85, которые далее связывают и активируют каталитические субъединицы PI3-киназы. При этом Рецепторы факторов роста, в том числе Рецептор PDGF в фибробластах и Рецептор EGF в эпителиальных клетках, дополнительно используют малую ГТФ-азу Ras для полноценной активации PI3-киназного комплекса. Весь процесс активации происходит около мембраны в связанном с рецептором состоянии. Для повышения эффективности используется принудительная локализация этого комплекса на мембране за счет множественных взаимодействий с рецептором и липидных якорей в молекуле Ras. Рисунок 83:

PI3-киназа служит одним из главных эффекторов инсулинового рецептора (InsR на рис. 83). Однако в этом случае за прямую активацию отвечает субстрат инсулинового рецептора – белок IRS (англ. insulin receptor substrate) (рис. 83). Наличие IRS является отличительной чертой инсулиновой сигнализации. Именно IRS опосредует передачу сигнала от рецептора ко всем нижестоящим мишеням, сохраняя общий принцип передачи сигнала с помощью тирозинового фосфорилирования. Фосфорилированный рецептором по остаткам тирозина IRS служит посадочной площадкой для сборки всех последующих инсулин-зависимых сигнальных каскадов, включая PI3-киназу. IRS привязывает этот процесс к мембране, поскольку содержит РН-домен, взаимодействующий с фосфоинозитидами.

На тирозинкиназных рецепторах (RTK) собираются PI-киназные комплексы, несущие α, β или δ каталитические субъединицы PI3-киназы. Рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR), активируют PI3Kγ изоформу PI3-киназы. В этом случае за активацию отвечает комплекс βγ-субъединиц гетеротримерных G-белков, но детали процесса пока малопонятны.

Заякоренная рецептором на мембране PI3-киназа фосфорилирует PIP₃ до PIP₂. Обратную реакцию гидролиза PIP₃ катализируют фосфатазы PTEN (англ. phosphatase and tensin homolog) и SHIP (англ. Src-homology 2 (SH2)-containing phosphatase – фосфатаза, содержащая SH2-домен -домен Src киназной гомологии 2 класса (порядка); домен адаптерных взаимодействий, гомологичный одному из доменов Src кинзы, связывает фосфорилированные тирозины (Src Homology 2)). PTEN дефосфорилирует PIP₃ по 3 положению гидроксильной группы (превращая его в PI-4,5-P₂), а SHIP – по 5 положению (при этом образуется PI-3,4-P₂). SHIP не полностью терминирует сигнал от рецептора, так как некоторые белки способны связываться и активироваться не только PIP₃, но и PI-3,4-P₂. Например, протеинкиназа PKB/Akt взаимодействует с обоими липидами. Продукт активности SHIP способен вызывать клеточные ответы как сходные с PIP₃, так и отличные от него. Фосфатаза PTEN является опухолевым супрессором и ее нарушения часто встречаются при опухолевых трансформациях, так как ведут к повышенной и неуправляемой миграторной и пролиферативной активности клеток. Функции PTEN и SHIP в регуляции направленной миграции клеток связаны с поляризацией цитоскелета и обособлением лидирующей мембраны, преимущественно содержащей актин, и задней части клетки, обогащенной миозином.

Образующийся в мембране PIP₃ связывает белки, имеющие в своем составе РН-домен (рис. 83). Многие белки, содержащие этот домен, активируются именно в результате связывания с PIP₃. К ним относятся факторы обмена ГДФ на ГТФ для малой ГТФазы Rac, и некоторые цитоплазматические тирозинкиназы. Активация Rac имеет прямое отношение к миграции клеток, так как это основной регулятор актиновой динамики и образования псевдоподий. Таким образом, Rac и активирующий его PI3-киназный сигнальный каскад являются основными регуляторами поляризации клеток.

Другие белки не активируются PIP₃, но просто связываются с мембраной, обогащенной этим липидом. Собираясь в одном месте мембраны, эти белки получают возможность взаимодействовать и активировать друг друга, тогда как, находясь в цитоплазме, они пространственно разнесены. Например, посредством своих РН-доменов с мембранным PIP₃ связываются протеинкиназа В (Akt) и активирующая ее фосфоинозитид-зависимая киназа (англ. phosphoinositide-dependent kinase-1, PDK1). Киназа PDK1 конститутивно активна, но, только связавшись с мембраной, оказывается вблизи своего субстрата PKB/Akt. Мишени PKB/Akt в клетке многочисленны (рис. 83), и их список продолжает увеличиваться. Они контролируют жизненно важные функции клетки. Это не только движение и поддержание метаболического баланса, но и стратегический выбор дальнейшей судьбы клетки. Именно через РКВ/Akt PI3-киназный каскад реализует действие гормонов, факторов роста и цитокинов в отношении роста, деления или дифференцировки, поддержания жизнеспособности или клеточной смерти, активного движения или метаболического баланса клеток. Дополнительные рисунки: