8. Что такое система редактирования генома crispr-Cas9, каким образом её можно использовать в исследовательских и медицинских целях?
CRISPR/Cas9 – технология редактирования генома высших организмов, базируюшаяся на иммунной системе бактерий. В 1987 году японские ученые частично секвенировали геном E. Coli и обнаружили в ДНК участок, содержащий повторяющиеся последовательности ДНК (≈29 нуклеотидов, повторяющихся 13-14 раз), разделенные вариабельными участками — спейсерами. Подобные «кассеты» повторов и спейсеров названы позднее CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. В 2002 году были открыты гены cas — гены локусов CRISPR, кодирующие белки Cas. В 2005 году Мохика и его коллеги опубликовали результаты своих новых исследований, в которых было установлено, что спейсеры соответствуют последовательностям из геномов бактериофагов, а также участкам плазмид. Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка. В начале 2000-х годов группа биоинформатика Евгения Кунина предложила гипотетическую схему механизма действия CRISPR/Cas-систем. Согласно их модели, при попадании вируса в клетку он обнаруживается с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. Если какой-либо фрагмент генома вируса совпал с записанным в спейсере, Cas разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.
Общие принципы:
Локусы CRISPR: 1)Короткие палиндромные повторы 30-40 нуклеотидов; 2) Спейсеры, длина сопоставима с длиной повторов; 3)гены CAS. Между генами CAS и рядом повторов-спейсеров расположена лидерная последовательность, содержащая промотор, с которого начинается однонаправленная транскрипция повторов и спейсеров CRISPR. Спейсеры полностью интегрированы в геном клетки и передаются её потомкам при делении.
Этапы CRISPR-опосредованного адаптивного иммунитета: адаптация, экспрессия и интерференция. На этапе адаптации в CRISPR встраивается новый спейсер, образованный из инородного генетического элемента, проникшего в клетку. На стадии экспрессии происходят транскрипция CRISPR и процессинг коротких CRISPR-РНК (crРНК), нацеленных на определённую мишень. В ходе интерференции рибонуклеопротеиновый комплекс crРНК-Cas распознаёт нуклеиновую кислоту-мишень за счёт комплементарного спаривания оснований мишени с crРНК, после чего разрезает мишень благодаря эндо- и/или экзонуклеазной активности белков Cas. Система CRISPR/CAS9 относится ко II классу, имеется только 1 эффекторный белок (эндонуклеаза CAS9). В системах этого типа в качестве направляющей РНК выступает не одна crРНК, а дуплекс crРНК и дополнительной РНК — tracrРНК. Дуплекс crРНК:tracrРНК направляет никазные домены RuvC и HNH Cas9 для внесения разрывов с образованием тупых концов в ДНК-мишени, которая должна иметь PAM около 3'-конца (чтобы не нацеливаться на спейсеры в собственном геноме и не разрушать его).
Т
ранскрипция
пре- crРНК происходит в бактериальной
клетке постоянно на низком уровне и
усиливается при стрессовом воздействии
(в тч вторжении вируса). Биогенез crРНК
в системах II типа имеет ряд уникальных
особенностей. В частности, для него
необходим процессинг РНКазой III и
связывание с пре-crРНК особых транс-кодируемых
CRISPR-РНК (tracrРНК). В составе tracrРНК
присутствует
участок, комплементарный той области
crРНК, которая была транскрибирована с
повтора CRISPR. В ходе процессинга crРНК
tracrРНК связывается с ещё не вырезанными
crРНК в составе пре-crРНК, благодаря чему
образуются зрелые crРНК. Первый этап
процессинга пре-crРНК происходит в
областях, комплементарных повторам
CRISPR; в результате образуется 3'-конец
crРНК. Последующая
стадия обрезания 5'-конца неизвестными
нуклеазами происходит внутри
последовательностей, соответствующих
спейсерам CRIPSR, образуется 5'-конец
crРНК. Для
накопления crРНК
в клетках необходим белок Cas9,
хотя неизвестно, вызвано ли это участием
Cas9 в процессинге crРНК или стабилизацией
crРНК при помощи Cas9 после процессинга,
или же и тем, и другим. Получающийся в
результате зрелый комплекс
crРНК-tracrРНК-Cas9
содержит короткую crРНК, у которой 20—24
нуклеотида комплементарны 3'-концу
спейсера
и 20—24 нуклеотида комплементарны 5'-концу
повтора.
Комплекс crРНК-tracrРНК-Cas9
распознаёт ДНК-мишени, комплементарные
crРНК и содержащие РАМ.
Как и в системах I типа, отсутствие РАМ
в локусах CRISPR предохраняет клеточную
ДНК от разрезания. Сначала Cas9
распознаёт РАМ,
а после этого прилегающая ДНК проверяется
на комплементарность crРНК. Разрезание
ДНК-мишени осуществляется путём внесения
двух одноцепочечных разрывов мотивами
RuvC
и HNH
белка Cas9, в результате чего образуется
двуцепочечный разрыв с тупыми концами
в ближнем к РАМ
конце протоспейсера в R-петле,
за три нуклеотида до РАМ. Место разрыва,
таким образом, определяется малой РНК.
Использование технологии для редактирования генома:
При редактировании генома эукариот результатом работы CRISPR-Cas9 является не разрушение всей молекулы ДНК, а репарация двуцепочечного разрыва, произведённого Cas9. Репарация может проводиться:
- за счет негомологичного соединения концов (NHEJ) (возникают небольшие вставки и делеции, разрушающие рамку считывания белок-кодирующих генов, что приводит к утрате функции гена-мишени, за счет множественных двухцепочечных возможно появление крупных делеций и инверсий);
-
путем
гомологичной рекомбинации (замена
удалённой последовательности новой
последовательностью, комплементарной
матрице для репарации, которую создаёт
сам исследователь), может использоваться
для удаления нежелательных мутаций,
создания новых аллелей, вставки или
слияния функциональных доменов.
инактивация доменов RuvC
или HNH Cas9
превращает этот белок в РНК-направляемую
никазу,
производящую не двуцепочечные, а
одноцепочечные разрывы. Инактивация
обоих доменов превращает Cas9 в направляемый
РНК ДНК-связывающий
белок, не
разрезающий мишень. В этом случае к
ДНК-связывающему домену можно присоединить
домен с другими функциями, что, в свою
очередь, может вызвать различные
изменения в локусе-мишени: активацию
или репрессию транскрипции, модификацию
хроматина, усиление образования петель
и многие другие. Кроме того, инактивированная
форма Cas9 (dCas9, «мёртвая» Cas9) служит основой
для новых исследовательских приёмов —
например, визуализации посредством
флуоресценции или создания меток для
последующей физической изоляции локусов.
В настоящий момент для редактирования генома применяют систему CRISPR-Cas II типа, причём чаще всего используется белок SpyCas9 (нуклеаза Cas9 бактерии S. pyogenes).
- crРНК и tracrРНК, транскрибируемые отдельно (четырехкомпонентная система РНКаза III:crРНК:tracrРНК:Cas9)
- двухкомпонентная система sgРНК:Cas9 – используется чаще
Д
оставка
sgРНК:Cas9: трансфекция
клеток
плазмидами, кодирующими sgРНК
и Cas9
методом электропорации или плазмидами,
кодирующими Cas9,
а РНК доставлять в виде наработанных с
помощью ПЦР ампликонов.
Новый способ (2015): «наноклубок» состоящий
из одной цепи ДНК, один из участков
которой комплементарен sgРНК,
т.о. комплекс sgРНК:Саs9
закрепляется внутри клубка. При контакте
с клеткой наноклубок попадает в эндосому,
полимер, покрывающий клубок разрушается
и даёт возможность sgРНК:Cas9 достичь ядра.
Кроме того применяются SaCas9
(Cas9 из Staphylococcus
aureus),
малый размер позволяет
упаковывать её в аденоассоциированный
вирус (AAV) для доставки вектора в клетки
живого организма в качестве терапевтического
средства.
dCas9 (неспособная к разрезанию ДНК форма Cas9):
- для метода CASFISH (флуоресцентной гибридизации in situ)
- для подавления или активации транскрипции гена-мишени
Метод самоклонирующихся CRISPR:
В этом случае в клетки вводят плазмиду, содержащую самоклонирующуюся палиндромную sgРНК, а также короткую двуцепочечную ДНК, которая содержит последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. Когда плазмида транскрибируется, образующаяся sgРНК в комплексе с Cas9 комплементарно связывается с последовательностью в плазмиде, кодирующей эту sgРНК. Cas9 вносит двуцепочечный разрыв, который репарируется путём гомологичной рекомбинации с использованием введённой двуцепочечной ДНК в качестве матрицы; в итоге плазмида вновь содержит последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. В отличие от стандартного метода CRISPR, для которого требуется длительная и трудоёмкая наработка специальных плазмид для каждого нового локуса-мишени, метод самоклонирующихся CRISPR позволяет сократить время эксперимента с шести дней до трёх часов и уменьшить его стоимость в шесть раз.
Применение:
- генная инженерия эукариот: растений, грибов, модельных организмов (мышей, плодовой мушки Drosophila melanogaster , нематоды Caenorhabditis elegans, рыбки данио-рерио)
- В 2013 году исследователи сумели отредактировать аномальный ген в стволовых клетках пациента, больного муковисцидозом
- 2016 года в Китае было произведено редактирование генома взрослого человека с помощью CRISPR/Cas: пациенту с раком лёгких ввели модифицированные с помощью CRISPR-Cas Т-лимфоциты.
- в 2015 редактирование генома человеческого эмбриона: в оплодотворенную яйцеклетку с бета-талассемией введен белок Cas9 и sgРНК, исправление путем репарации по здоровой матрице. В 5–10% эмбрионов мутация, ответственная за возникновение болезни у взрослых людей, действительно была исправлена, однако это привело к множеству мутаций. точное редактирование получается, когда участок ДНК-мишени длиной чуть больше 20 нуклеотидов комплементарно взаимодействует с полностью соответствующим ему РНК-гидом, но последовательность-мишень в геноме вариабельна.
нерешенные проблемы: откуда берутся спейсеры?, их эволюционно происхождение?, молекулярный механизм распознавания мишени?