Результат модификаций гистонов.

Гистоны синтезируются в цитоплазме, после чего транспортируются в ядро. Наиболее высокий уровень синтеза гистонов совпадает с S-фазой клеточного цикла, т.к. они необходимы клетке в этот период. Сразу после синтеза гистоны приобретают специфический модификационный паттерн и ассоциируются с шаперонами, которые облегчают их осаждение на ДНК.

Наиболее значительные изменения в структуре хроматина происходят во время транскрипции специфических генов, синтеза ДНК в течение S-фазы клеточного цикла и конденсации хромосом в течение митоза.

Ацетилирование. В новосинтезированных гистонах ацетилированы К5, К12 гистона Н4 и К18, К1 гистона Н3. В течение транспорта из цитоплазмы в ядро, гистоны приобретают дополнительные модификации (H3K9me, H3K56Ac).

Ацетилирование гистонов, как правило, ведет к активации транскрипции генов.

В транскрипционно активных областях хроматина высокое содержание моноацетилированных гистонов H3 и H4, что свидетельствует об их особой роли в процессе активации транскрипции. Моноацетилирование К6 – главная модификация гистона H4 в клетках животных. Удаление фермента, катализирующего модификацию H3K16 приводит к фрагментации ядра, что еще раз свидетельствует о важной роли этой модификации. Ацетилированные гистоны располагаются в области промотеров генов. Ацетилирование гистонов происходит быстрее, чем метилирование.

Метилирование. Метилированные гистоны (за исключением h3k4me) располагаются по всей области генов.

Метилирование гистонов играет наиболее значительную роль в создании эпигенетической информации, в то время как остальные модификации имеют модулирующую функцию (например, могут иметь роль сигнальных молекул для приема внешнего сигнала хроматином).

Фосфорилирование. Фософорилирование гистонов совпадает с началом митоза, который начинается с фосфорилирования линкерного гистона H1. Хвосты (N-концевые части) коровых гистонов подвергаются фосфорилированию во время деления клетки (Т3, S10, S28 гистона Н3 и S1 гистона Н4).

6. Объясните, каким образом эпигенетические модификации хроматина влияют на активность генов? Приведите примеры молекулярных механизмов? (в т.ч. см. МБ 5)

Эпигенетическая регуляция – процесс, приводящий к изменению активности гена без изменений его кодирующей последовательности.

В процессе развития многоклеточных организмов меняется активность генов - одни активны, другие неактивны (временно).

Эпигенетические модификации (характеристика):

-обратимо изменяют экспрессию генов или фенотип клетки, изменяя доступность ДНК для транскрипции,

-не связаны с нарушением нуклеотидной последовательности ДНК,

-могут приводить к сохранению неактивного или активного состояния генов в ряду митотических делений соматических клеток, а также могут передаваться следующим клеточным поколениям,

-обусловлены работой специфических энзимов, но могут происходить «спонтанно» (без ферментов).

Типы ЭМ:

• ДНК-метилирование,

• модификации гистонов (ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, АТФ-рибозилирование, сумоилирование, убиквитинирование),

• вариантные формы гистонов,

• ремоделлинг нуклеосомы – изменение позиции нуклеосомы АТФ-зависимым путем,

• РНК-интерференция, РНК-асссоциированное подавление транскрипции и трансляции (это не модификация хроматина, но тоже можно упомянуть об этом механизме).

1. Метилирование ДНК— обратимая ковалентная модификация ДНК, происходящая в результате присоединения метильной группы в 5-м положении цитозинового нуклеотида с образованием 5-метилцитозина.

П ри присоединении ДНК-метилтрансферазы к ДНК водородные связи цитозина (цитозин метилируется значительно чаще, чем аденин) с комплементарным основанием гуанина (G) разрываются, СН₃- присоединяется к цитозину в 5 положении. Затем водородные связи между 5-mC и G восстанавливаются.

Цитозин метилируется, если рядом с ним находится гуанин (G) в сочетании CрG, где р - остаток фосфорной кислоты, связывающийся с сахарными остатками с образованием сахарофосфатного остова ДНК (CpG-динуклеотиды).

После репликации метилированной ДНК новообразованная цепь не будет метилированной. ДНК-метилтранфераза узнает и метилирует С, комлементарный G в новообразованной цепи - распределение метилированных оснований поддерживается при репликации ДНК.

Спонтанное дезаминирование С приводит к превращению в урацил, который устраняется спец ферментами и заменяется С вновь. Дезамин-е 5-mC приводит к тимину (при репликации GC пара превратится в АТ, что может привести к вредной мутации, закрепляемой при репликации ДНК).

Существует 2 группы ДНК-метилтранфераз: метилирует de novo, фермент, дометилирующий новообразованную цепь при репликации (поддерживающие метил-е).

Метилирование ДНК ведет к конденсации хроматина, не нарушает способность к комплементарному взаимодействию, препятствует взаимодействию регуляторных белков (факторов транскрипции -ФТ) с промотором и способствует привлечению к району промотора белков, подавляющих транскрипцию. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя связыванию специфических транскрипционных факторов. Помимо этого, метилированные районы ДНК связывают methyl binding domain-содержащие белки, привлекающие транскрипционные репрессоры или белки, модифицирующие гистоны (Большинство MBD-содержащих белков – репрессоры или корепрессоры транскрипции (могут формировать комплексы с деацетилазами гистонов (репрессорами))).Гетерохроматин (транскрипционно инертный) характеризуется наличием метилированной, поздно реплицирующейся ДНК.

Однако в отдельных случаях метилирование может препятствовать взаимодействию участка ДНК с репрессорными белками, подавляющими активность гена и конкурирующими за связывание ДНК с белками, обеспечивающими транскрипцию гена. Некоторые транскрипционные факторы наоборот имеют повышенное сродство к метилированным сайтам.

Нарушение метилирования: гипометилирование может привести к активации протоонкогенов, генов ростовых факторов, гена активатора плазминогена урокиназного типа, гена гепараназы и кальций-связывающего протеина, способствующих метастазированию; чрезмерное метилирование генов-супрессоров, подавляющих злокачественный рост, - к развитию рака.

Метилированию в норме подвергается 2-7% цитозиновых остатков ДНК (в 70% случаев цитозин метилируется в составе динуклеотидов С-G (CpG). СpG участки обычно базируются в зонах промотеров).

Значение метилирования: - регуляция структуры хроматина и генной экспрессии, - сайленсинг повторяющихся и интегрированных чужеродных последовательностей ДНК, - формирование профиля экспрессии, характерного для данного типа клеток, - геномный импринтинг (активные гены определяются полом организма, от которого эти гены унаследованы, например, ген, пришедший от отца, сильнее метилирован и неактивен, тогда как гомологичный материнский ген активно транскрибируется), - инактивация одной Х-хромосомы у женщин, - канцерогенез (гиперметилирование генов-супрессоров, гипометилирование онкогенов, ФР).

2. Ферментная ковалентная модификация гистонов (ацетилирование, метилирование, убиквитинирование, фосфорилирование):

М одификации N-хвостов гистонов происходит значительно чаще, чем остальных частей гистонов. Свободные «хвостовые» домены содержат аминокислоты лизин, аргинин, серин. Эти домены обладает + зарядом, и, взаимодействуя с отрицательно заряженными фосфатными группами цепи ДНК, определяют стабильность структуры нуклеосомы.

П ри изменении общего заряда белка и, соответственно, изменении структуры хроматина – освобождается доступ транскрипционных факторов к ДНК. Сочетание различных модификационных процессов создает т.н. «гистоновый код», во многом определяющий сущность и порядок считывания генетической информации, функциональное состояние участков генома.

Модификации гистонов изменяют электростатическое взаимодействие между гистонами и ДНК: либо понижают + заряд на хвостах гистонов, что приводит к их диссоциации от ДНК, либо способствуют связыванию белков, распознающими модифицированные гистоны. 

Ацетилирование гистонов в области промотеров генов, как правило, ведет к активации транскрипции генов.

3. АТФ-зависимое ремоделирование хроматина – изменение связывания ДНК с гистонами (перемещение или удаление нуклеосом);

Интенсивность экспрессии генов зависит от густоты расположения нуклеосом в активно экспрессирующихся участках генома. Ремоделирование хроматина — это процесс активного изменения «густоты» нуклеосом и сродства гистонов с ДНК.

Нуклеосомы могут быть собраны в состав хроматина или удалены, коровые гистоны могут быть заменены на вариантные, может быть изменена позиция нуклеосом по отношению к последовательности ДНК. АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие факторы - структурно и функционально различные белковые комплексы, но все они содержат белки из SNF2-семейства АТФаз (каталитич субъединица).

4.   Включение в состав хроматина вариантных гистонов.

Для всех гистонов, кроме Н4, показано существование вариантных гистонов, которые могут заменять канонические в составе нуклеосом. Предполагается, что нарушения регуляции сборки хроматина, содержащего вариантные гистоны, может вести к возникновению онкологических заболеваний, устойчивости раковых клеток к лекарственным препаратам, стерильности, нарушений в ЦНС и быть связано со старением.

Механизм «эпигенетической памяти» клетки «запоминает» паттерн гистоновых модификаций и сохраняет его при делении.

Включение вариантов гистонов H3 и H2A, например, H3.3, CENP-A или H2A.Z, в состав нуклеосом коррелирует с функциональной спецификацией регионов генома. В активно транскрибирующихся генах вместо гистона Н3 встраивается его вариант Н3.3. Гистон H3.3 может служить эпигенетической меткой, позволяющей поддерживать активное состояние экспрессии генов в ряду клеточных поколений. Положение центромеры в хромосомах и поддержание ее идентичности в ходе клеточных делений определяется эпигенетически с помощью цетромер-специфичного варианта гистона H3 – cenH3 (CENP-A). 

Вариантная форма гистона Н2А — H2AZ обнаруживается в нуклеосомах активно транскрибирующихся участков хроматина и предотвращает образование факультативного гетерохроматина. 

5. РНК-ассоциированное подавление экспрессии генов

РНК-индуцированная ингибиция может осуществляться на различных этапах считывания генетической информации. Двухцепочечная молекула РНК расщепляется с помощью фермента Dicer на фрагменты длиной 21-25 нуклеотидов, образуя так называемую siRNA (small interfering RNA). Такие РНК способны образовывать комплексы с протеинами (RISC) и вызывать деградацию матричной РНК, то есть не допускать синтеза белка после успешного образования РНК (посттранскрипционная ингибиция).

Помимо этого имеет место быть РНК-зависимое метилирование ДНК и гистонов: siRNA имеют структуру, гомологичную промотерам ряда генов и способны индуцировать метилирование этих промотеров, присоединяясь к ним и активируя ДНК-метилтрансферазы.

Несколько возможных вариантов участия siRNA в ингибировании экспрессии генов: 1)прямое связывание РНК со специфическим транспортным белком Argonaute 2 и непосредственное связывание структуры с комплементарной последовательностью в промотере гена с дальнейшим включением механизма деацетилтрования гистонов и остановкой транскрипции.

2) опосредованное действие: связывание siRNA с известными репрессирующими комплексами – Mi2/NuRD и Sin3. Включают гистондеацетилазы и ДНК-метилтрансферазу, т.е. обладает способностью к метилированию ДНК и деацетилированию гистонов.