7.Опишите систему Cre-lox, объясните, как её можно использовать для кондиционного выключения генов?
Система рекомбинации Cre-lox используется для таргетинга, т.е. целенаправленного изменения определенных генов за счет гомологичной рекомбинации последовательностей, находящихся в хромосоме, с искусственно введенными в клетку последовательностями ДНК. Эту систему Cre-lox взяли от бактериофага Р1.
Если у клеток есть специальные сайты loxP, и они экспрессируют рекомбиназу Cre, то между сайтами loxP возможна рекомбинация (эти сайты могут специфически связывать эту рекомбиназу).
Рисунок 1. Сайты loxP состоят из 34 нуклеотидов. Две крайние части – это палиндромные последовательности (последовательность ДНК, состоящая из смежных инвертированных повторов, одинаково считывающихся и в левом направлении одной цепи, и в правом направлении другой цепи). А центральная часть асимметрична и может быть разной.
Cre вносит двухцепочечный разрыв ДНК, который потом зашивается ДНК-лигазой. Есть 3 возможных результата рекомбинации в зависимости от ориентации сайтов loxP:
1.Инверсия. Если два loxP сайта инвертированы, то произойдет инверсия гена между ними (при условии, что loxP находятся на одной хромосоме).
2.Делеция гена, если loxP сайты идут в прямой последовательности (при условии, что loxP находятся на одной хромосоме).
3.Транслокация, если loxP находятся на разных хромосомах.
Таким образом, можно нокаутировать какие-либо гены и смотреть, какое влияние оказало это выключение на организм животного. Таким образом, можно точно установить функцию каждого гена, а значит, понять механизмы нормального развития организма и формирования определяемых наследственностью заболеваний.
Нокаут с использованием системы Cre-lox называется кондиционный нокаут (или программируемый), т.е. нокаут при выполнении какого-то условия, этим условием и является наличие рекомбиназы Cre.
Использование стратегии "программируемого нокаута гена" требует создания двух линий мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем тканеспецифичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта, фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена. Следует отметить, что вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов, но не должны затрагивать функциональные последовательности. Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток, где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre. Используя стратегию "программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при использовании стандартной процедуры нокаута генов.
На всякий случай кратко о традиционной схеме нокаута генов: получение векторной конструкции, с последующим внесением ее в культуру эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и отбор трансформантов. Трансформированные ЭСК вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации.
Почему кондиционный нокаут лучше? Потому что:
Ген выключен только в присутствии активной рекомбиназы
Можно контролировать включение и выключение
Животное нормально развивается (это хорошо, так как при null-мутациях в традиционном подходе основная проблема – это летальность)
Фенотип легче интерпретировать, так как ген можно выключить только в определенной популяции клеток.
Один из вариантов таргетинга, при котором происходит инактивация одного из генов с одновременным введением на его место другого функционирующего гена, получил название "knock-in".
1)В качестве вставки для “knockin” часто используют кДНК флуоресцентного белка (например, GFP –green fluorescent peptide). При этом все клетки, экспрессирующие измененный ген будут флуоресцентно мечеными. Это облегчает их выделение и детекцию в животном.
2
)Ещё
один «популярный» вариант вставки –
рекомбиназа Cre (часто в одной кассете с
GFP), которая замещает кодирующую часть
гена. Такой трюк позволяет не только
нокаутировать ген в определенной
популяции клеток, но и индуцировать в
этой популяции нокаут других генов.
Различные возможности кондиционного нокаута:
Возможна замена экзона гена на экзон с точечной аминокислотной заменой или любой другой мутацией
Вставка в 3’НТР гена кассеты с внутренним сайтом посадки рибосом позволяет создавать бицистронные аллели, не нарушая экспрессию изучаемого гена
Вырезание и рекомбинацию можно сделать направленной, чтобы объединять фрагменты разных молекул
Схема с тремя сайтами loxP, которая позволяет включать экспрессию маркера при делеции гена (т.н. нокаут-репортер)
Индуцируемый нокаут
Включение/выключение гена или трансгена при активации Cre и т.д.