9. Как можно оптимизировать условия ферментации для получения максимального количества целевого продукта - антибиотика?

Все продукты клеточного метаболизма условно можно разделить на первичные и вторичные метаболиты. К вторичным метаболитам (идиолитам) они относят различные специфические соединения, которые могут образовываться как ответ на воздействие различных внешних факторов, которые приводят к нарушению нормальных метаболитических процессов (антибиотики, стероиды, алкалоиды). К таким неблагоприятным факторам относятся нехватка питательных веществ, загрязнение культуральной среды продуктами метаболизма, добавление различных токсичных веществ и т.д. Синтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит не всегда, а лишь в определенных условиях, обычно неблагоприятных для клеток (обычно с конца Log-фазы и до конца фазы отмирания).

Процесс промышленного биосинтеза идиолитов проходит две фазы или стадии (двустепенчатое культивирование), резко различающиеся по условиям проведения. Во время первой фазы (трофофазы) основной задачей является накопление максимально возможного количества биомассы, которая выращивается на среде оптимальной для роста данного микроорганизма (ростовая среда). Из экономических и технологических соображений эта фаза должна быть максимально быстрой, а питательная среда дешевой и содержать легко усваиваемые субстраты (глюкоза, фруктоза). На второй фазе создаются условия обеспечивающие запуск и активный синтез вторичного метаболита. На этой фазе ферментацию обычно ведут на так называемой продуктивной среде, которая по своему составу значительно отличается от ростовой, т.к. содержит, в основном, трудноусваиваемые углеводы. Переключение клеток с легко усваиваемых субстратов (глюкоза) на более сложные (лактоза, сахароза) требует синтеза большого количества новых индуцибельных ферментов, что является для клеток “встряской”, аналогичной той, которую может испытать человек при резком торможении или маневре на автомобиле, который двигался с большой скоростью. Наработанная на первом этапе (в трофофазе) клеточная культура может быть перенесена (пересеяна) на продуктивную среду в другом аппарате или культивирование может осуществляться на сложных питательных средах, содержащих как легкоусваиваемые, так и трудноусваиваемые компоненты. Поскольку в структуру молекул многих вторичных метаболитов кроме углерода, водорода и кислорода входит значительное количество азота, серы, фосфора, то в состав продуктивных сред обязательно нужно добавлять в необходимых количествах нитраты, соли аммония и фосфорной кислоты и другие микроэлементы. Существует целый ряд физических (температура, рН, освещение светом определенной длины волны и интенсивности) и химических (добавление веществ-предшественников, поддержание определенной, обычно высокой концентрации кислорода) факторов благоприятствующих синтезу вторичных метаболитов.

Основной способ получения - направленный биосинтез антибиотиков, осуществляется путем культивирования (прямой ферментации) подходящего микроорганизма - продуцента. Точный механизм индуцирования первичными метаболитами генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма, до конца не расшифрован, однако известно, что биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных метаболитов, начинается в фазе замедленного роста клеточной популяции (конец трофофазы) и достигает максимума в идиофазе. Считают, что в конце трофофазы (середина и конец стационарной фазы) в клетках и культуральной среде происходит накопление избыточных количеств продуктов первичного метаболизма, некоторые из которых выступают в роли индукторов вторичного метаболизма, освобождающих гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболитной репрессии. Другим, важным стрессовым фактором, индуцирующим гены вторичного метаболизма, является резкое уменьшение содержания или полное исчерпание в питательных средах легкоусваиваемого компонента - глюкозы, что заставляет клетки переключаться на усвоение более сложных субстратов (другие моносахариды, дисахариды, полисахариды). Необходимость синтеза большого количества индуцибельных ферментов в условиях нехватки питания и как следствие промежуточных метаболитов, существенно дезорганизует процессы нормального метаболизма и запускает различные механизмы адаптации, в том числе и синтеза антибиотиков.

Специальные опыты показали, что выход цефалоспорина С уменьшается при переходе от использования в качестве источника углерода сахарозы к быстро усваиваемому углеводу глюкозе. Наиболее оптимальной средой для образования антибиотика культурой Streptomyces antibioticus оказалась смесь 0,1 % глюкозы и 1 % галактозы. При таком соотношении моносахаридов глюкоза быстро утилизируется и микроорганизм переключается на усвоение галактозы, что и инициирует идиофазу.