1.1. Протеомные методы валидации потенциальных мишеней.

Протеомные методы незаменимы для предварительной валидации потенциальных мишеней, позволяющей исключить из списка явно «неправильные» мишени. Первоначально необходимо проверить, существует ли реально в целевом организме белок, выбранный в качестве потенциальной мишени чисто теоретически, на основе анализа генома патогенного микроорганизма. Возможно, эти гены являются “молчащими”, и не зависимо от причин отвечающий им белок, скорее всего, придется исключить из списка потенциальных мишеней. Для этой цели полностью подходит стандартная схема протеомного картирования белков микроорганизма: 1) получение биологического образца; 2) экстракция белков; 3) разделение белков (двумерный электрофорез или хроматография); 4) идентификация белка и установление его структуры (молекулярной массы и аминокислотной последовательности). В случае создания антимикробного средства с широким спектром действия необходимо проверить экспрессию целевого белка у всех микроорганизмов целевой группы.

В результате предварительной валидации белков-мишеней должны быть получены протеомные карты для различных штаммов целевых микроорганизмов. Если обнаружится вариабельность экспрессии белка в разных штаммах, то такой белок должен быть исключен из списка потенциальных мишеней по соображению возможного проявления лекарственной резистентности.

1.2. Геномные методы валидации потенциальных мишеней.

Последующая валидация мишеней, успешно прошедших проверку протеомными методами, может быть выполнена различными геномными методами, включающими такие процедуры как:

• Инактивация целевого гена в результате мутаций;

• Подавление транскрипции гена;

• Разрушение целевой мРНК (использование рибозимов и малых

интерферирующих РНК (siRNA);

• Подавление трансляции (использование антисмысловых РНК и их

аналогов);

• Прямая инактивация целевого белка с помощью специфических

антител конъюгированных с ингибиторами белков.

Большинство этих подходов основано на одной общей идее - проверить функциональную значимость потенциальной белковой мишени путем остановки ее экспрессии на одном из этапов «от гена до белка».

2. Установление пространственной структуры мишеней.

Наиболее рациональный путь нахождения соединения-прототипа нового лекарства - это компьютерное конструирование лекарства на основе его соответствия пространственной структуре белка-мишени (молекулярный докинг). Дня реализации данного подхода необходима трехмерная структура биомишени.

Информация о пространственной структуре белка выбираемого в качестве мишени является очень жестким ограничением, которое может отсеять большую часть потенциальных мишеней, удовлетворяющих другим требованиям.

Основные методы расшифровки пространственных структур белков

Для экспериментального исследования пространственной структуры мишени применяют в основном два метода: рентгеноструктурный анализ (РСА) и многомерный вариант спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Эти методы используют для водорастворимых белков, т.к. для анализа требуется получения растворов или монокристаллов белка.

Информация о пространственной структуре белков депонируется в базе данных PDB и доступна через сеть Интернет для свободного пользования.