44. Для чего необходима операция наработки продуцента в промышленных биотехнологических процессах?

Современные биотехнологические процессы характеризуются использованием аппаратов – ферментеров большого объема (50-500 м³). Запуск процесса культивирования и выведение его на рабочий режим (достижение оптимальной плотности клеточной культуры) является одной из самых сложных и длительных процедур. Часто процесс приходится останавливать в самый последний момент и начинать все сначала из-за попадания в аппарат посторонней микрофлоры или потери клетками, по разным причинам, частично или полностью своих продуктивных свойств. Поэтому приготовления посевного материала является одним из самых сложных, длительных и ответственных этапов всего процесса.

Для любого микробиологического производства всегда необходима исходная культура продуцента, которая, как правило, не отличается высокой стабильностью при хранении. Поэтому, обычно, предприятие один раз в 2-3 месяца получает чистую культуру в количестве 3 пробирок из специальной лаборатории профильной фирмы или НИИ, либо в условиях собственной заводской лаборатории организует ее хранение и контроль микробиологической чистоты используемого штамма. При этом обычно одну пробирку с исходным продуцентом используют на размножение исходного штамма, вторую используют для организации микробиологического контроля за исходным штаммом-продуцентом, третью оставляют в резерве.

Объем пробирки и количество клеток микроорганизма в ней ничтожно мало по сравнению с объемом ферментера и поэтому прямой пересев культуры потребует очень длительного времени, пока не будет достигнута необходимая плотность культуры во всем аппарате. С целью сокращения времени на запуск процесса в производственных условиях наработку необходимого количества биомассы осуществляют, как правило, в несколько стадий (не более 4-х) в специальных аппаратах.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм микроорганизма или споровый материал (для грибов или актиномицетов), сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам большего объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты).

Окончательную наработку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины-окончания Log-фазы, что позволяет сильно сократить время адаптации клеток (Lag-фазу) при переносе их на питательную среду в производственный ферментер.

По своей конструкции и технологической оснастке инокулятор для аэробных микроорганизмов аналогичен основному ферментеру и снабжен сходными системами аэрирования, перемешивания, термостатирования.

45. Ретроингибирование и его роль в процессах метаболизма. Отрицательная роль ретроингибирования в промышленном биосинтезе. Расскажите как можно уменьшить эффект ретроингибирования в промышленном биосинтезе?

Регуляция обмена веществ микробной клетки может происходить путем изменения ферментативной активности имеющихся ферментов. Это явление наблюдается преимущественно в анаболитических процессах. Наиболее изученным механизмом является ингибирование активности ферментов конечным продуктом (ретроингибирование), когда активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата тормозится конечным метаболитом.

Благодаря этому явлению у микроорганизмов предотвращается перепроизводство низкомолекулярных промежуточных продуктов обмена, таких, как аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды. Как правило, субстрат ингибируемого фермента резко отличается от конечного продукта - ингибитора и это обстоятельство позволяет считать, что конечный продукт соединяется не с активным центром фермента, а со специальным регуляторным или аллостерическим (от греч. «аллос» – другой, «стерос» – пространственный), центром. Присоединение конечного продукта к аллостерическому центру фермента сопровождается утратой нормальной каталитической активности вследствие конформационных изменений структуры белковой молекулы. По сравнению с индукцией и репрессией ретроингибирование это инструмент быстрого и точного регулирования метаболитических процессов.

Ретроингибирование является крайне нежелательным явлением при промышленном получении тех или иных интересующих человека клеточных метаболитов, т.к. препятствует их накоплению в высоких концентрациях, что требует использования установок большего объема и усложняет процесс их выделения и очистки. А это в свою очередь увеличивает себестоимость продукции. Существует несколько подходов, позволяющих снять или значительно уменьшить эффект ретроингибирования. Один из них состоит в том, что целевой продукт (ингибитор), удаляют. Например, если он является эндометаболитом, то создаются условия для его ухода из клетки в культуральную жидкость, например за счет повышения проницаемости клеточных оболочек. Другой подход состоит в том, что в культуральную среду добавляют метаболитический предшественник целевого продукта, синтез которого блокируется этим продуктом (добавление антраниловой кислоты при биосинтезе триптофана). Мутации фермента, затрагивающие аллостерический центр, так же являются эффективным способом снятия ретроингибирования.