1. Резистентность микроорганизмов к лекарствам. Основные механизмы резистентности. Факторы и причины быстрого распространения резистентности. Основные подходы к преодолению и подавлению лекарственной резистентности.

Резистентность - феномен устойчивости штамма возбудителей инфекции к действию одного или нескольких антибактериальных препаратов, снижение чувствительности (устойчивость, невосприимчивость) культуры микроорганизмов к действию антибактериального вещества, прежде всего к антибиотику. Усто́йчивость (или резисте́нтность) к антибио́тикам может развиваться в результате естественного отбора посредством случайных мутаций и/или благодаря воздействию антибиотика. Микроорганизмы способны быстро переносить генетическую информацию устойчивости к антибиотикам путём коньюгации плазмид, в которых локализованы гены резистентности (горизонтальный перенос генов). Быстрому распространению резистентности способствует то, что коньюгация может быть не только внутривидовой, но и межвидовой и даже межродовой; возможна «вспышка» - вся микрофлора может стать резистентной к антибиотикам. Первоисточник генов резистентности находится в почве у почвенных микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Они могут передаваться через промежуточных хозяев патогенным микроорганизмам. Кроме того, антибиотико-резистентность микроорганизмов может быть создана искусственно методом генетической трансформации. Например, внесением генов в геном микроорганизма.

Механизмы резистентности

• У микроорганизма может отсутствовать структура, на которую действует антибиотик (например, бактерии рода микоплазма (лат. Mycoplasma) нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки);

• Микроорганизм непроницаем для антибиотика (большинство грам-отрицательных бактерий невосприимчивы к пенициллину G, поскольку клеточная стенка защищена дополнительной мембраной);

• Микроорганизм в состоянии переводить антибиотик в неактивную форму (многие стафилококки (лат.  Staphylococcus) содержат фермент β-лактамазу, который разрушает β-лактамовое кольцо большинства пенициллинов);

• В результате генных мутаций, метаболизм может быть изменён таким образом, что блокируемые антибиотиком биохимические реакции или мишени больше не являются критичными для выживания данного микроорганизма.

В 2002 году в Канаде была принята Всемирная декларация по борьбе с антимикробной резистентностью, в которой указывается, что резистентность к антибиотикам коррелирует с их клинической неэффективностью, она создается человеком, и только человек может решить эту проблему, а необоснованное применение антибиотиков населением, неправильные представления и недооценка проблемы резистентности врачами и фармацевтами, назначающими антибиотики, может привести к распространению резистентности.

Существует несколько путей преодоления резистентности бактерий к антибиотикам. Один из них — это защита известных антибиотиков от разрушения ферментами бактерий или от удаления из клетки посредством мембранных насосов.

Первый подход основан на использовании «защищенных» полусинте-тических пенициллинов и цефалоспоринов. Защита антибиотика заключа-ется в замене ацильных остатков, присутствующих в природных антибио-тиках на другие. Такая замена изменяет пространственное строение молеку-лы и препятствует ее взаимодействию с активным центром бетта-лактамаз.

Второй подход основан на использовании специальных веществ- ингибиторов бета-лактамаз, проявляющих в низких концентрациях ингибиторную активность, а в высоких — обладающих антибактериальными свойствами. Примером может служить клавулановая кислота, галогенизированные пенициллановые кислоты, сульфон пенициллановой кислоты (сульбактам). Клавулановая кислота и сульбактам блокируют гидролиз пенициллина стафилококками. Наиболее широко используют в качестве ингибиторов бета-лактамаз клавулановую кислоту и сульбактам.

Перспективными подходами к преодолению резистентности бактерий к антибиотикам представляются также применение комбинаций антибиотиков; проведение целевой и узконаправленной антибактериальной терапии; синтез новых соединений, относящихся к известным классам антибиотиков; поиск принципиально новых классов антибактериальных препаратов.

2. При получении БАВ растительного происхождения можно использовать в качестве источника сырья резервы дикой природы, плантационные культуры и культуры растительных клеток. Определите возможности и преимущества биотехнологического процесса получения ЛС с помощью культур растительных клеток?

ЛС биотехнологическим способом из культуры растительных клеток получают после выращивания каллусных тканей с использованием специальных методов.

Достоинства способа:

1. Отсутствие влияния климатических, сезонных и географических факторов;

2. Сокращение использования посевных площадей под выращивание лекарственных растений;

3. Возможность получения как известных веществ (хинин, кодеин и др.), присущих интактному растению, так и синтез новых веществ не синтезируемых соответствующим целевым растением;

4. Использование клеточных культур для биотрансформации полученных продуктов;

5. Решение проблем дефицита исходного ЛРС, ценных и исчезающих видов, не поддающихся плантационному культивированию;

6. Более высокое качество и стандартность получаемого сырья по содержанию целевого продукта;

6. Получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, радионуклидов и тяжелых металлов;

7. Возможность управления биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и др. способами;

8. Возможность индустриализации и удешевление производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.

3. Проанализируйте на конкретных примерах преимущества биотехнологического производства витаминов?

Витамины (от лат. vita – жизнь + амины) – низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, абсолютно необходимые для нормальной жизнедеятельности организмов. Витамин являются незаменимыми компонентами, т.к. за исключением никотиновой кислоты они не синтезируются организмом человека и поступают главным образом в составе продуктов питания. В отличие от других жизненно важных пищевых веществ витамины не обладают пластическими свойствами и не используются организмом в качестве источника энергии. Участвуя в разнообразных биохимических превращениях, они оказывают регулирующее влияние на обмен веществ и тем самым обеспечивают нормальное течение практически всех биохимических и физиологических процессов в организме.

Многие коферменты являются производными витаминов и, поэтому нарушение обмена веществ при витаминной недостаточности опосредовано через понижение активности определенных ферментов.

Традиционные способы получения витаминов основаны либо на переработке больших количеств ценного и часто очень редкого, растительного или животного сырья, либо (в редком случае) на химическом синтезе, следовательно, витаминная промышленность нуждается в более эффективных технологиях, и такие технологии успешно создаются.

С помощью генно-инженерных манипуляций (воздействием на регуляцию метаболизма) были получены штаммы микроорганизмов, которые производят в десятки тысяч раз больше витаминов, чем необходимо для их роста. Это штаммы Ashbya gossypii – продуцент рибофлавина, штаммы Pseudomonas denitrifikans и Propionibacterium freudonreichii, производящие витамин В12 и др. В России на базе бактерий рода Bacillus subtilis сконструирован эффективный продуцент витамина В2.

Помимо широкого применения в медицине в качестве профилактических и лечебных средств, получаемые микробиологическим путем витамины В2 и В12 добавляют в пищу животным для сбалансирования кормов.

Получение витамина В12 .

Витамин В12 очень важен в коррекции определенных нарушений в организме человека и животных. Он регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование гемоглобина, применяется для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени и в других случаях.

В 1972 г. в Гарвадском университете был осуществлен химический синтез витамина В12, включающий 37 стадий его получения, что лишало возможности организовать рентабельное промышленное производство этого витамина. Поэтому раньше витамин В12 получали исключительно из природного сырья (1тонна печени – 15 милиграмм витамина). Единственный способ его получения в настоящее время – это микробиологический синтез в промышленном масштабе. Продуцентом витамина В12 являются пропионовокислые бактерии из рода Propionibacterium. Применение мутантов и добавление в среду предшественника витамина В12 - 5,6 диметилбензимидазола (5,6 ДМБ) резко повышает продуктивность продуцента. Этому способствует также добавление в питательные среды кукурузного и мясного экстракта, соевой муки, рыбной муки. Выращивание пропионовых бактерий производится периодическим методом в анаэробных условиях на среде с кукурузным экстрактом, глюкозой, солями кобальта и сульфатом аммония. Образующиеся кислоты нейтрализуются щелочью. Через 72 часа после начала ферментации вносят предшественники - 5,6 ДМБ. Длительность ферментации – трое суток. Полученную массу сепарируют, стабилизируют нитритом натрия, охлаждают, нейтрализуют, коагулируют белки и фильтруют. Очищают на ионообменной смоле, кристаллизуют и проводят химическую очистку продукта. Далее следует получение различных лекарственных форм поливитаминных препаратов. Для увеличения производства витамина В12 перспективным является применение генной инженерии при получении гибридных штаммов и использовании методов иммобилизации на полимерах.

Другим примером использования биотехнологии в производстве витаминов является получение аскорбиновой кислоты. Промышленное производство аскорбиновой кислоты представляет собой комбинированный процесс, включающий в себя несколько стадий химического синтеза и одну стадию биотрансформации d -сорбитола в L-сорбозу, осуществляемую с помощью уксуснокислых бактерий.

4. В биотехнологическом производстве лекарственных средств, в частности для получения алкалоидов, довольно часто морфологическая специализация клеток является основной предпосылкой для активного синтеза. Какова связь между количественным выходом алкалоидов и свойствами каллусной культуры клеток?

Способность культур тканей растений к синтезу и накоплению вторичных метаболитов является установленным фактором. Однако для многих культур до сих пор не удается определить условия накопления продуктов, хотя бы в количествах, характерных для родительских растений. Как правило, клеточные культуры, напрямую полученные из растений, характеризуются низким содержанием искомых веществ. Это связано с тем, что в растениях обычно синтез и накопление вторичных метаболитов разобщены во времени и происходят в разных органах или тканях, а синтез их в недифференцированных тканях сильно репрессирован или вообще невозможен. Только благодаря использованию методов селекции и правильно разработанной технологии культивирования высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы их получение было рентабельным с экономической точки зрения.

Обычно в качестве источника клеток для получения культуры ткани проводят поиск наиболее продуктивных растений в надежде, что эта способность будет перенесена и в культуру. Однако однозначной зависимости между продукционной способностью растения и клеточной культуры, полученной из него обычно не наблюдается.

В настоящее время большое число экспериментальных данных свидетельствует о том, что образование и накопление вторичных продуктов в растениях - сложный, пространственно и повременно организованный процесс, который часто в той или иной форма включает транспорт этих соединений на клеточном и субклеточном, уровнях. В целом ряде случаев показано резкое разграничение мест первичного синтеза и накопления алкалоидов. Установлено, что, эти два процесса могут быть локализованы в различных клетках в пределах одного и того, же органа или даже одной и той же ткани.

В культурах тканей растений также как и в растениях, накопление вторичных метаболитов зачастую тесно связано с процессом вторичной тканевой дифференциации. В таких культурах обычно наблюдается формирование секреторные канальца, млечники, слизевые клетки, железки или специализированные клетки, где накапливаются конечные продукты, т.е. происходит процесс разобщения синтеза и накопления вторичных веществ. В недифференцированных клетках и тканях синтез таких продуктов сильно репрессирован.

Установлено, например, что практически все клетки в каллусе Macleya microcarpa обладают способностью синтезировать изохиноликовые алкалоиды, однако их накопление осуществлялось лишь в специализированных, так называемых "алкалоидных" клетках.

Исследователи, работающие с культурами тканей, неоднократно наблюдали, что при образовании в каллусной ткани морфологических структур (побегов, корней, эмбриоидов и т.д.) содержание искомых продуктов в культуре увеличивается. Например, культура ткани Atroра belladonna при недифференцированном росте не продуцировала гиосциамин, а при образовании корней в каллусе, начинается синтез алкалоида. Сердечные гликозиды наперстянки синтезировались только при образовании в культуре ткани эмбриоидов.

5. Для эффективного проведения биотехнологического процесса большое значение имеет питательная среда, в которой микроорганизмы-продуценты БАВ используют в качестве источника азота различные азотсодержащие соединения, содержащие аминный азот или ионы аммония. Какие условия проведения ферментации по источнику азота при получении антибиотиков будут являться оптимальными?

Соединения - источники азота усиливают рост биомассы продуцентов беталактамных, полиеновых антибиотиков (эритромицин, рифамицины), но отрицательно влияют на биосинтез самих антибиотиков. Поэтому выращивание продуцента антибиотика на начальных этапах ферментации в обедненных азотсодержащими соединениями средах нецелесообразно из-за малой скорости накопления биомассы в трофофазе.

Увеличению биосинтеза антибиотиков в идиофазе способствует значительное уменьшение в среде источников азота, особенно легкоусвояемых. При этом происходит дерепрессия ферментов синтеза антибиотиков.