1.2.1 Серологія
Вірус є помірно імуногенним. Чотири моноклональних антитіл миші, щоб очистити вірусні частинки були зроблені з титрами від 1/8,000 до 1/32,000, з яких тільки один, похідний від поверхні антигенного детермінанта, окрасили всю частку вірусу завдяки використанню імуно-електронної мікроскопії [9]. Зішкріб кори зрілої лози - найкраще джерело антигена для серологічного тестування. DAS-ELISA з поліклональною антисироваткою може бути використано для виявлення вірусу у зараженій лозі, але нерівномірний розподіл і низька концентрація антигена в тканині рослини може впливати на достовірність цього тесту [8, 10].
Антисироватка отримана на основі рекомбінантного вірусного білка руху експресована в Escherichia coli була використана для чутливого виявлення вірусу в уражених тканинах виноградної лози та для ідентифікації внутрішньоклітинних місць накопичення білка руху [64].
Більш надійні результати виходять, коли поліклональна антисироватка використовуються для захоплення антигену в білок, потім фермент-кон'юговані моноклональні антитіла для виявлення антигену. Моноклональні антитіла виявляють вірус у N. benthamiana за допомогою блот - аналізу тканини.
Рис.1.12 Вірусні частнки засвічені завдяки вірус-специфічними антитілами, коньюговані колоїдним золотом. Шкала = 100 нм [64].
ELISA тести є досить простими і здатні дати результат за один або 2 дні. Для усішного проведення тестів ELISA анти сироватка для кожного збудника захворювання повинна знаходитися в лабораторії, а зразки винограду мають братися лише з відповідних тканин у потрібний час року, і бути в хорошому фізичному стані [11].
Однак, існує певне обмеження для проведення ІФА. Воно полягає в тому, що не до кожного вірусу винограду вироблені спеціальні сироватки. Таким чином, виноград може бути заражений певним вірусом, але якщо антисироватки проти цього вірусу не існує, то тести ELISA не будуть здатні його виявити.
Ще одна проблема, яка може завадити проведенню серологічних досліджень, - це чистота антисировотки. У деяких випадках сироватка може реагувати з більш ніж одним вірусом, або навіть з іншими компонентами рослинного соку, які були присутні з вірусом, коли антидот був зроблений. Це може призвести до неочікуваних результатів, або потенційно помилкових позитивних результатів [42].
1.2.2 ПЛР
Вивлення вірусу: А-вірус винограду
Методи: RT-PCR, and IC-RT-PCR
Загальні відомості
Вірусу був виділений із листків, пагонів і бруньок винограду. Дослідження було проведено за допомогою ПЛР зі зворотною транскрипцією (RT-PCR), Імунно – захоплююча зворотня транскрипційна ПЛР (Immuno-Capture reverse
transcription PCR).
Матеріали і методи
Для обох методів був обраний один і той самий набір праймера, який використовується для дослідженн А-вірусу винограду в тестованих зразках
Праймери:
Продукт ПЛР: 430 по білкового білка
Праймер 1 – комплементано-змістовний праймер: C995: 5’AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG 3’
Праймер 2 – антизмістовний праймер: H587: 5’GACAAATGGCACACTACG 3’ [27, 43, 45].
1.2.2.1 RT-PCR
Виділення РНК з стебла винограду і черешків для проведення ЗТ-ПЛР
Порізати зразок (0,5-0,7 г стебла або черешка) на шматки скальпелем і занурити у азотний розчин в ступці
Додати 5 обємів рослинної ваги в лимонному буфері (50 мМ, рН 5,6), що містить 2% PVP і 20 мМ of DIECA.
Подрібнювати дуже добре зразки за допомогою карборудмаксу (carborudpmax) до поки не отримаємо зелений розчин гомогенату.
Перемістити гомогенат в центрифужні пробірки і центрифугуваи при 10000 об/хв. Протягом 10 хв при температурі 4ºС.
Розподілити відібраний супернатант на аліквоти і зберігати при температурі –80ºC до використання.
Розвести екстракт до 40% в дистильованій воді, що містить 1% Triton X-100.
Інкубувати при 65ºC протягом 15 хв.
Синтез кДНК (остаточний об’єм 25 мкл)
До 5 мкл екстрагованої РНК, додати 15 мкл суміші зворотної транскрипатзи (ЗТ буфер 1Х, 0,4 мМ dNTP, Гекса праймер 100 нг, 0,1 М DTT).
Інкубувати при 100ºC протягом 2 хв до поки не відбудеться денатурація.
Помістити у лід на 2 хв.
Інкубувати протягом 10 хв при кімнатній температурі.
Додати 1 виміру ферменту ЗТ (розведеного в 5 мкл води)
Інкубувати при 37ºC протягом 1 год.
Зберігати при -20ºC до використання в ПЛР [27, 43, 45].
1.2.2.2 IC-RT-PCR
Розбавити поліклональні антитіла, отримані за допомогою Sanofi Kit (ряд розведень за методикою Санофі) в буфері (карбонат бікарбонат) і внести 100 мкл в кожну лунку на пластині для ELISA.
Інкубувати пластину при 37ºC 2 год.
Виділення – всі кроки мають бути виконані при температурі 4ºC
Подрібнити 0,5-0,7 г черешків в азотному розчині.
Додати 5 обємів виділеного буферу (що містить 2% PVP і 0.1% of Tween 20) і подрібнити їх в присутності карборунда.
Зібрати гомогенат і центрифугувати його при 10000 об/хв протягом 10 хв при 4ºC.
Перенести супернатант в нову пробірку..
В решті-решт, помістити 100 мкл екстракту (супернатанту) в кожну лунку
Інкубувати пластину при 4ºC протягом всієї ночі.
ЗТ-реакція
Приготувати суміш ЗТ (RT buffer 1X, DNTPs 0.4 mM, Hexa primer 100 ng, 0.1 M DTT, 1% Triton X-100, enough dH2O as required) і нагрівати до 65ºC протягом кількох хв.
Промити пластину тричі, використовуючи PBST.
Додати 20 мкл нагітої суміші ЗТ в кожну лунку, і потім інкубувати пластину при 65ºC потягом 15 хв.
Помістити пластинку в лід і «пошкодити» вірус 5-10 секундами піпеткування розчину в кожну лунку, потім перенести вміст лунок в мікрофужну пробірку.
Інкубувати пробірки при 100ºC протягом 2 хв, поотім при температурі 4ºC ( на льоду) близько 3 хв, і вкінці-кінців при кімнатній температурі ще 10 хв.
Додати 5 мкл дистильованої води, що містить 1 виміру ферменту ЗТ , в кожну пробірку.
Інкубувати пробірки при 37ºC протягом 1 год.
Зберігати при -20ºC до використання в ПЛР.