Окислительная модификация белков. Джрб.

Анализ результатов окислительного повреждения белков представляет собой более сложную задачу, нежели окислительных повреждений ДНК, поскольку по сравнению с одним сахаром и четырьмя основаниями ДНК белки содержат 20 разнообразных по структуре аминокислот, каждая из которых может быть атакована АФК разнообразными путями.

Количественно, белки более повреждаемая мишень, чем ДНК и липиды, они являются главной мишенью в клетках при воздействии наиболее реакционной формы АФК – гидроксильных радикалов, более чувствительной, чем ДНК и липиды. Окислительные повреждения белков приводят к существенным нарушениям в работе большинства клеточных систем и процессов. Данные повреждения проявляются в изменении функций рецепторов, ферментов, транспортных белков, ответственны за формирование антигенов, способных вызвать аутоиммунную реакцию и т.п. Следует отметить, что молекуле фермента обычно содержится несколько ароматических аминокислот, дисульфидных (-SS-) связей и сульфгидрильных групп (-SH) (АТФазы или дегидрогеназы) такие группы наиболее легко окисляются в результате свободнорадикальной атаки. Однако разрушение только некоторых из этих группировок в близи активного центра приводит к инактивации фермента.

Окисление белков различными АФК может приводить к образованию аминокислотных радикалов, которые, реагируя с кислородом, образуют пероксильные органические радикалы, которые в свою очередь способны к образованию многочисленных продуктов окисления.

Взаимодействие пептидов и белков с АФК состоит из следующих ключевых реакций:

RCHR₁R₂ + HO^  RC^R₁R₂ + H₂O

RC^R₁R₂ + O₂  RC(^O₂)R₁R₂

RC(^O2)R₁R₂ + HO₂^  RC(OOH)R₁R₂ + O₂

RC^R₁R₂ + HO^  RC(OH)R₁R₂

где R, R_1, R₂ – различные аминокислотные остатки

При рассмотрении окислительных повреждений белков, имеет смысл выделять два типа таких окислительных модификаций - окисление аминокислотных остатков и самой полипептидной цепи.

Рис. 1. Пути окисления белковых молекул, обусловленного АФК.

На рис. 1 показаны стадии окисления полипептидной цепи по двум наиболее распространенным путям. Если рассматривать окисление полипептидной цепи под действием гидроксильного радикала, что является наиболее типичным в случае воздействия ионизирующих излучений (реакция a), то этот процесс всегда начинается с отрыва атома водорода от альфа-углеродного атома одной из аминокислот. Остатки всех алифатических аминокислот являются потенциальными мишенями для АФК альфа-углеродные атомы аминокислотных остатков являются наиболее вероятной точкой атаки гидроксильных радикалов. При этом образуется альфа-углеродный алкильный радикал белка (с). Источником гидроксильного радикала может также служить распространенная в водных растворах реакция Фентона (b). Наиболее обычным для алкильного радикала процессом при нормальных условиях является присоединение молекулы растворенного в воде кислорода (d). При этом образуется алкилпероксильный радикал, который в присутствии гидратированного супероксид-анион радикала (НО2•) или ионов металлов переменной валентности способен восстанавливаться до алкилпероксида (e).

Подобные перекиси белков, так же в присутствии железа, меди или супероксида, переходят в форму алкоксильных радикалов (f) и далее - в гидроксипроизводное пептида (g).

-углеродные радикалы, окси- и пероксирадикалы полипептидов могут далее реагировать с окружающими органическими структурами, окисляя их с образованием разнообразных «сшивок» и агрегатов или формируя на них новые углеродные радикалы, способные к дальнейшим превращениям:

R¹C^ или R¹OO^ или R¹O^ + R²CH  R²C^ + R¹H или R¹OOH или R¹OH

Сшивки белковых молекул образуются в основной массе при отсутствии кислорода, в этом случае, вместо того чтобы вступить в реакцию (d), алкильный радикал может прореагировать с гомологичным радикалом, образовав углерод-углеродную ковалентную связь:

R¹C^ + R²C^  ¹RCCR²

Образование белковых «сшивок» и гидроксилирование белков - не единственное последствие реакции пептидной связи с гидроксильными радикалами. Наличие алкоксильного радикала в полипептидной цепи может привести к ее разрыву при химической модификации, схематически отраженной на рисунке 2. Как видно из схемы, деструкция полипептидной цепи может идти двумя путями - -амидным (b) и диамидным (a).

Рис. 2. Пути разрыва пептидной связи через окисление основной цепи.

Разрыв аминокислотной цепи -амидным путем осуществляется через алкоксильный радикал, который, образуя иминопроизводное, спонтанно гидролизуется с освобождением двух пептидных фрагментов. Новообразованный C-конец после этой модификации существует в виде амидного производного, а N-конец – в виде кетоацильного производного.

В том случае, когда дефрагментация белка идет по диамидному пути, то на С-конце пептидного фрагмента, образовавшегося из N-концевого участка изначальной молекулы, формируется диамидная структура. На N-конце второго фрагмента образуется изоцианидное соединение.

Все аминокислотные остатки в составе белков способны оксисляться при взаимодействии с гидроксильным радикалом, однако продукты этих взаимодействий определены пока лишь частично. В таблице представлены продукты окисления боковых остатков аминокислот, наиболее подверженных атаке АФК и исследованных в этом плане.

Таблица 1. Продукты окислительной модификации остатков наиболее окисляемых аминокислот.

Аминокислота	Продукты окисления
Цистеин	нитрозотиилы, тиоловые радикалы, цистин, коньюгаты с глутатионом
Метионин	метионинсульфоксид, метионинсульфон
Триптофан	кинуренин, 3-гидроксикинуренин, гидропиролиндол, оксииндол, N-формилкинуренин, 3-гидроксилкинуренин
Фенилаланин	2,3-гидроксифенилаланин, 2-,3-,4-гидроксифенилаланин
Тирозин	3,4-дигидроксифенилаланин, дитирозин (2,2’- бифенилпроизводные)
Гистидин	2-оксогистидин, 4-ОН-глутамат, аспартат, аспарагин
Аргинин	глутаминовый полуальдегид
Лизин	2-аминоадипиновый полуальдегид
Пролин	глутаминовый полуальдегид, 2-пирролидон, 4- и 5-гидроксипролин, пироглутаминовая кислота
Треонин	2-амино-3-кетобутиловая кислота
Глутаминовая кислота	пировиноградная кислота

Окислительная модификация боковых остатков некоторых аминокислот может, подобно механизмам, описанным выше, также приводить к дефрагментации белковой молекулы. Такой процесс возможен при воздействии АФК на остатки пролина и дикарбоновых аминокислот - аспарагиновой и глутаминовой. Для других возможны различные пути окисления (реакции – см. слайды)

Остатки тирозина окисляются АФК по двум путям с образованием тирозиновых димеров или 3,4-дигидроксифенилаланина (DOPA) (рис 6).

Рисунок 6. Пути окисления тирозина. Формирование редокс-активных соединений.

Полагают, что дитирозин, является наиболее перспективным биомаркером взаимодействия белков с АФК. А DOPA способен проявлять окислительно-восстановительную активность при обратимом переходе в форму семихинона, в связи с этим белки, содержащие это окисленное производное, способны к окислительно-восстановительным переходам. Поэтому считается возможным их участие в развитии ряда патологий, связанных со старением. В частности, предполагается, что они способны генерировать гидроксильные радикалы, катализируя реакцию Фентона.

Окислительное дезаминирование.

Аналогично альфа-амидному пути разрушения пептидной связи любая из аминокислот в N-концевой позиции может подвергаться дезаминированию:

NH₂CH(R)CONHR² + HO^ + HO₂^  NH₃ + RCOCONHR² + H₂O₂

Как и альфа-амидное расщепление пептидной связи, процесс приводит к отщеплению аммиака и формированию альфа-кетоацильного производного на N-конце полипептидной цепи (реакции – см. слайд). Эти реакции образования карбонильных групп относятся исключительно к модельным системам, в которых окислительному воздействию подвергаются отдельные белки. В системах in vivo их образование может проходить иначе, так как белки находятся в окружении других органических соединений.

Аминокислоты и белки, реагируя в присутствии кислорода с короткоживущими радикалами различного происхождения, образуют долгоживущие реакционноспособные интермедиаты – гидроперекиси аминокислот и белков. Эти гидроперекиси на свету, при воздействии тепла или в результате взаимодействия с ионами переходных металлов образуют производные радикалы, включая алкоксильные (белок-О^), углеродные (белок-С^) и пероксильные (белок-ОО^). Для многих модельных систем генерации АФК, о которых упоминалось при рассмотрении окисления белков, показано формирование долгоживущих радикалов белка (ДЖРБ, долгоживущие активные формы белков (ДАФБ)), включая воздействие гаммма-, рентгеновского, ультрафиолетового излучений и пероксинитрита. Времена полужизни ДЖРБ достигают свыше 20 ч.

ДЖРБ могут вызывать повреждения различных биологических молекулярных структур, так как белки участвуют во всех основных процессах в клетках и тканях. ДЖРБ способны создавать множество интермедиатов (промежуточных веществ) осложняющих протекание окислительного стресса в биологических системах.

Окисленные формы белков являются одним из ранних и стабильных маркеров окислительного повреждения клеток.