8. Характеристика днк-полимерз e.Coli: размеры, субъединичный состав,

ферментативные активности и участие в процессах репликации и репарации.

ДНК-полимераза III-холофермент(3 – 900 кДА) – ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится всего 10-20 молекул ДНК-полимеразы III, но тем не менее она является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в синтезе лидирующей цепи и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки.

ДНК-полимераза 3 осуществляет синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки, при синтезе запаздывающей цепи. Это димерный фермент с 10 каталитическими центрами. 10 полипептидов холофермента сформированы в 4 функциональные группы: 1) 2-а каталитических центра (альфа, эпсилон,тетта) – ДНК-полимеразная активность.два каталит ядра состоят каждое из -субъединиц (обладает полимеразной активностью), ( эпсилон )-субъединица ( 3′5′ экзонуклеазной активностью)и ( тетта )-субъединицы -стимулирует экзонуклеазу . Комплекс - и -субъединиц характеризуется значительно более высокими полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. 2) две субъединицы (тау) соединяют два каталитические ядра(обеспечивают присоединение второго ядра). 3) две копии гомодимера «зажима» (бетта)  - фиксируют каталитические ядра на матричных цепях и обеспечивают процессивность фермента. (1 половина работает на одной цепи, 2 на второй) 4) Клэмп-лоудэр– комплекс состоящий из 5 субъединиц -комплекс – обеспечивает за счет гидролиза АТФ «загрузку зажима» - сборку -димеров вокруг матричных цепей. В результате ассоциации всех компонентов ДНК-полимеразы III-холофермента образуется комплекс с молекулярной массой, составляющей 10³ килодальтон– основной фермент репликации ДНК. Роль -субъединицы заключается в том, чтобы максимально снизить вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования. Точная же функция других субъединиц неизвестна.

Снятие бета-комплексов с ДНК по завершении синтеза. (пси, хи, тетта, тау).

Структура ДНК-полимеразы 3: сборка происходит в несколько этапов: клэмп-лоудэр соединяет бета-субъединицы с ДНК праймером (используя энергию АТФ). Далее бета-субъединицы меняют конформацию (там где она контактирует с клэмп-лоудером) – обнаруживают высокое сродство к минимальному ферменту – полимераза прикрепляется к ДНК. Затем тау-димер(соединяют два каталитические ядра) связывается с полимеразой – и связывает субъединицы альфа(полимеразной активностью). Клэмп-лоудер отвечает за окружение каждой из двух цепей матрицы парой бета-димеров, а также за снятие бета-комплекса с ДНК по завершении синтеза. Рисунок читать

9. Структура днк-полимеразы III e.Coli, функции ее отдельных

субъединиц. Модель работы димерной полимеразы; координация синтеза

ДНК на комплементарных нитях.

ДНК-полимераза III-холофермент(3 – 900 кДА) – ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится всего 10-20 молекул ДНК-полимеразы III, но тем не менее она является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в синтезе лидирующей цепи и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки.

ДНК-полимераза 3 осуществляет синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки, при синтезе запаздывающей цепи. Это димерный фермент с 10 каталитическими центрами. 10 полипептидов холофермента сформированы в 4 функциональные группы: 1) 2-а каталитических центра (альфа, эпсилон,тетта) – ДНК-полимеразная активность.два каталит ядра состоят каждое из -субъединиц (обладает полимеразной активностью), ( эпсилон )-субъединица ( 3′5′ экзонуклеазной активностью)и ( тетта )-субъединицы -стимулирует экзонуклеазу . Комплекс - и -субъединиц характеризуется значительно более высокими полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. 2) две субъединицы (тау) соединяют два каталитические ядра(обеспечивают присоединение второго ядра). 3) две копии гомодимера «зажима» (бетта)  - фиксируют каталитические ядра на матричных цепях и обеспечивают процессивность фермента. (1 половина работает на одной цепи, 2 на второй) 4) Клэмп-лоудэр– комплекс состоящий из 5 субъединиц -комплекс – обеспечивает за счет гидролиза АТФ «загрузку зажима» - сборку -димеров вокруг матричных цепей. В результате ассоциации всех компонентов ДНК-полимеразы III-холофермента образуется комплекс с молекулярной массой, составляющей 10³ килодальтон– основной фермент репликации ДНК. Роль -субъединицы заключается в том, чтобы максимально снизить вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования. Точная же функция других субъединиц неизвестна.

Снятие бета-комплексов с ДНК по завершении синтеза. (пси, хи, тетта, тау).

Структура ДНК-полимеразы 3: сборка происходит в несколько этапов: клэмп-лоудэр соединяет бета-субъединицы с ДНК праймером (используя энергию АТФ). Далее бета-субъединицы меняют конформацию (там где она контактирует с клэмп-лоудером) – обнаруживают высокое сродство к минимальному ферменту – полимераза прикрепляется к ДНК. Затем тау-димер(соединяют два каталитические ядра) связывается с полимеразой – и связывает субъединицы альфа(полимеразной активностью). Клэмп-лоудер отвечает за окружение каждой из двух цепей матрицы парой бета-димеров, а также за снятие бета-комплекса с ДНК по завершении синтеза.

10 полипептидов организованы в 4 функциональные группы: 1)два каталит ядра состоят каждое из -субъединиц (обладает полимеразной активностью), -субъединица ( 3′5′ экзонуклеазной активностью)и (тетта)-субъединицы (стимулирует экзонуклеазу) . Комплекс - и -субъединиц характеризуется значительно более высокими полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. 2) две субъединицы  соединяют два ядра(обеспечивают присоединение второго ядра). 3) две копии зажима  - надежно фиксируют катал ядра на матричных цепях и обеспечивают процессивность фермента (1 половина работает на одной цепи, 2 на второй) 4) Клэмп-лоудэр– комплекс состоящий из 5 субъединиц -комплекс – обеспечивает за счет гидролиза АТФ «загрузку зажима» - сборку -димеров вокруг матричных цепей. В результате ассоциации всех компонентов ДНК-полимеразы III-холофермента образуется комплекс с молекулярной массой, составляющей 10³ килодальтон. Роль -субъединицы заключается в том, чтобы максимально снизить вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования. Точная же функция других субъединиц неизвестна.

Структура ДНК-полимеразы 3: сборка происходит в несколько этапов: клэмп-лоудэр соединяет бета-субъединицы с ДНК праймером (используя энергию АТФ). Далее бета-субъединицы меняют конформацию (там где она контактирует с клэмп-лоудером) – обнаруживают высокое сродство к минимальному ферменту – полимераза прикрепляется к ДНК. Затем тау-димер(соединяют два каталитические ядра) связывается с полимеразой – и связывает субъединицы альфа(полимеразной активностью). Клэмп-лоудер отвечает за окружение каждой из двух цепей матрицы парой бета-димеров, а также за снятие бета-комплекса с ДНК по завершении синтеза.

Холофермент ДНК-пол 3 асимметричен, поскольку клэмп-лоудер в нем всего один. вследствие этой асимметрии минимальный фермент в его половинках различают по своей способности «расставаться» с ДНК. Одна полисераза синтезирует непрерывную ведущую цепь, а другая-фрагментарную отстающую цепь. Клэп-лоудер находится при той субъединице, которая строит отстающую цепь, оказывая ей ключевое содействие в синтезе обособленных фрагментов Оказаки.

1ядро и зажим держит и синтез лидирующую цепь, а 2 – запаздывающую так, что образ петля: 1конец петли нах в зажиме, а 2- нах праймаза и синтез затравки.

В репликации принимают участие: хеликаза - раскручивает цепь, SSB белки связываются с однонитевыми участками и поддерживают их в таком состоянии. Праймаза синтезирует РНК-затравки. ДНК-пол 3 идет по основной цепи в направлении раскрытия вилки и одна половина репликазы (полимеразы) занята синтезом ведущей цепи, а другая инициирует и терминирует франменты Оказаки отстающей цепи внутри одноцепочечной петли. Репликативную вилку создает хеликаза, перемещаясь в направлении 5-3 по матрице отстающей цепи. Хеликаза соединяется с двумя каталитическими субъединицами ДНК-пол.

С каждой цепью матрицы ассоциировано по одному минимальному ферменту. Холофермент непрерывно движется вдоль матрицы для ведущей цепи, матрица для отстающей цепи образует петлю. DnaB создает точку расплетения перемещаясь по ходу ДНК. DnaB контактирует с тэта субъединицей, устанавливая таким образом прямую связь между комплексом хеликазы-праймазы и минимальным ферментом ДНК-пол 3. Это сцепление увеличивает скорости движения минимального фермента в десять раз и предотвращает соскакивания полимеразы с ведущей цепи. Синтез ведущей цепи приводит к образованию петли одноцепочесной ДНК. После инициации фрагмента Оказаки полимераза отстающей цепи протягивает одноцепочечную матрицу сквозь бета-зажим, синтезируя новую цепь.

Все компоненты репликативного аппарата функционируют процессивно, за иссключением праймазы и бета зажима. По завершению синтеза фрагмента они отпускают петлю. Клэмп-лоудер привлекает новый бета-зажим для инициации след фрагмента оказаки. Полимераза в каждом цикле переходит из одного бета-зажима в другой. В репликонах oriC связь прайминга с репликативной вилкой обеспечивается свойствами DnaB, производит взаимодействие с праймазой.после синтеза затравки праймаза освобождается. РНК-затравка запускает синтез отстающей цепи.