7. Механизм реакции полимеризации днк и его катализ. Экзонуклеазные
активности ДНК-полимераз и их роль в обеспечении точности
воспроизведения ДНК.
Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистое основание, сахар (пентоза) – дезоксирибонуклеотид (рибоза) и фосфат. Азотистое основание имеет пуриновое или пиримидиновое кольцо, которое связано с сахаром (в 1 положении). 2 пурина – А,Г, и 2 пиримидина – Ц, Т. А-Т – 2 водородные связи, Г-Ц – три водородные связи.
Внутренняя часть спирали гидрофобна. Синтез новых нуклеотидов осуществляет ДНК-полимераза. Она удлиняет цепь ДНК по принципу комплементарности. С 5’ – 3’ ОН конца. Предшественник всех нуклеотидов дНТФ (2’ дезоксинуклеотидтрифосфат).
Синтез в полимеразе: дНТФ сближается в полимеразе с ОН-активным концом в результате катализа отщепляется пирофосфат, а затем они расщепляются до 2Р пирофосфатазой.
В ДНК-полимеразе находится комплекс матричная ДНК и праймер и в нее попадает предшественик дНТФ . дНТФ – три фосфата – альфа, бета, гамма.
ДНК-полимераза помогает различать правильные и неправильные нуклеотиды. Активный центр фермента – карман, в который попадают нуклеотиды и связываются внутри фермента с другими. Связываются –ОН и дНТФ через альфа-фосфат (фосффоиэфирными связями). Альфа-фосфат некомплементарного нуклеотида находится очень далеко, поэтому ошибки случаются 1 раз на 10 000 раз.
Должен быть механизм, при котором ОН активный конец должен различать правильные и неправильные нуклеотиды. Эту функцию выполняет ДНК-полимераза 1.
(РЕПАРАЦИЯ — восстановление)
РЕПЛИКАЦИЯ (- повторение) (редупликация), самовоспроизведение нуклеиновых к-т .
Непосредственно активация – дивалентным катионом. ДНК-полимераза меняет конформацию при спаривании комплементарных дНТФ с матрицей в активном центре фермента. Большинство ДНК-полимераз – процессивные ферменты. У Е. коли – 5 ДНК-полимераз: 18.4
ДНК-полимеразы могут обладать экзонуклеазной активностью. Они используеют 3΄ – 5΄экзонуклеазную активность для удаления неправильных оснований. При этом фермент меняет свою конформацию и цепь попадает в центр корректировки. ДНК-полимераза 1 способна делать ник-трансляцию. 5-3, 3-5 экзонуклеазная активность. Вырезает неправильные и вставляет правильные – репарирующий механизм.
Полимеризация – удлинение цепочки ДНК. Принимают участие: хеликаза - раскручивает цепь, SSB белки связываются с однонитевыми участками и поддерживают их в таком состоянии. Праймаза синтезирует РНК-затравки на отстающей нити. ДНК-пол 3 идет по основной цепи в направлении раскрытия вилки и синтез цепь. Другой своей частью она синтез фрагменты Оказаки. ДНК-пол 1продолжает удлинять фрагменты и гидролизует предыдущий фрагмент. Лигаза сшивает. 3′5′ экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого последующего нуклеотида и удаление ошибочно спаренного нуклеотида с растущего конца цепи ДНК. Способность ДНК-полимеразы I удлинять 3′-конец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между отдельными сегментами в цепях ДНК. С помощью 5′3′ экзонуклеазной активности вырезаются небольшие, до 10 рибонуклеотидов, участки, которые являются затравками для синтеза фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза способна удлинять 3′-конец одной из цепей в месте разрыва и одновременно удалять нуклеотиды с 5′-конца того же разрыва.
