72 Гемолиз Титрование комплемента Титр и рабочая доза

Тип реакции - реакция иммунного гемолиза.

Исследуемый материал - свежая сыворотка крови.

Дополнительные ингредиенты реакции: гемолитическая система (гемолитическая сыворотка в рабочей дозе и 3% взвесь эритроцитов барана).

Положительная реакция - гемолиз; отрицательная - задержка гемолиза.

Титр комплемента - наибольшее разведение комплемента, в котором наблюдается гемолиз.

Применение: для определения титра комплемента. Если речь идет о титровании комплемента перед постановкой РСК, то титр определяют для дальнейшего расчета рабочей дозы. Используется разведение на 25% концентрированнее, чем титр.

73 РСК

Реакция связывания комплемента

Цель: серодиагностика: определение Ат в сыворотке пациента; сероидентификация: определение Аг (исследуемый материал).

Сущность - используется две конкурирующие системы Аг и Ат и один комплемент. Реакция связывания комплемента 1 система – основная (исследуемая или тест-система):

Серодиагностика: сыворотка больного (Ат) + антиген + комплемент (реакция связывания комплемента).

Сероидентификация: исследуемый материал, содержащий Аг (моча, ликвор, носоглоточный смыв и др.) + диагностическая сыворотка (известные Ат) + комплемент (реакция связывания комплемента).

Реакция связывания комплемента 2 система - индикаторная или гемолитическая: выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы: эритроциты барана и антиглобулиновая кроличья сыворотка - свободный комплемент вызывает гемолиз. При отсутствии свободного комплемента (связывание с 1 системой) – задержка гемолиза

РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для; 1) серологической диагностики инфекционных заболеваний 2) идентификации бактерии и др. микробов. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем: 1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным; 2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.

Компоненты реакции: 1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут); 2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов); 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) 3 % взвесь эритроцитов барана, 6) физиологический раствор; 7) контрольная сыворотка.

Комплемент, В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.

Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.

Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

74 Современные серологические реакции с меткой Особенности:  Используют метку (флюоресцеин, фермент или изотоп), которую соединяют (конъюгируют) с Аг или Ат.  Реакции происходят быстрее (экспресс) и качественнее.  Высокочувствительны и возможна точная регистрация специальными приборами.  Их проводят на стекле или полистироловых планшетках с лунками.

Требования к меткам:  Не изменять специфичность Ат и Аг;  Быстро и легко выявляться;  Определяться количественно. Современные серологические реакции с меткой Основные виды меток:  Светящиеся красители – флюорохромы (РИФ);  Электронно-плотные белки (ИЭМ);  Ферменты (ИФА);  Радиоактивные изотопы (РИА).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, реакция Кунса) ПРЯМОЙ МЕТОД: Бактерия в мазке + сыворотка, меченная флюорохромом = свечение в виде каймы зеленого цвета. НЕПРЯМОЙ МЕТОД: 1) бактерия в мазке + кроличья диагностическая сыворотка, 2) отмывание антител, не связавшихся с антигенами бактерий, 3) + антиглобулиновая (антикроличья) сыворотка, меченная флюорохромом = свечение в виде каймы зеленого цвета. Иммуноферментный анализ  Наиболее распространен твердофазный ИФА – когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Иммуноферментный анализ Фермент:  пероксидаза хрена  -галактозидаза  щелочная фосфатаза Иммуноферментный анализ Цель – серодиагностика (идентификация Ат) 1) сорбированный в лунке антиген + сыворотка больного, 2) отмывание несвязавшихся реагентов путём тщательного промывания лунки, 3) + антиглобулиновая (античеловеческая) сыворотка, меченная ферментом, 4) отмывание несвязавшихся реагентов путём тщательного промывания лунки, 4) + субстрат для фермента + хромоген = изменение цвета хромогена. Иммуноферментный анализ Цель: сероидентификация (идентификации антигена) В лунке сорбируют специфические антитела + искомый антиген + иммунная сыворотка против антигена, меченная ферментом + субстрат для фермента + хромоген (метод «сэндвича»). ИФА применяют для диагностики инфекций, определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях – 10-12 г/л.

Радиоиммунологический анализ Сущность: аналогичен ИФА.

Недостатки: метод представляет определенную экологическую опасность.  РАДИОНУКЛИДЫ  125I,  14C,  3H,  51 Cr и др.

Иммуноблотинг  электрофоретическое разделение антигенов в полиакриламидном геле;  перенос их на микропористую нитроцеллюлозную мембрану;  обработка моноклональными антителами;  выявление преципитатов с помощью меченной антиглобулиновой сыворотки (напр. в РИФ, ИФА). НЕПОЛНЫЕ АНТИТЕЛА  одновалентные антитела, не образующие видимого глазом гигантского иммунного комплекса в ходе реакций агглютинации или преципитации  блокирующие антитела, реагины

климат, воздержанные солнечные ванны. Не лишней будет и витаминная терапия и т.д.