Лабораторна діагностика.
Матеріал для досліджень. В якості досліджуваного матеріалу беруть шматочки уражених тканин, рановий вміст, eкcудат, випіт при набряках; при харчових токсикоінфеціях – блювотні маси, прогмивні води шлунка, випорожнення, кров, залишки підозрілої їжі; при псевдомембранозному коліті – біоптати слизової оболонки сігми та випорожнення. В разі необхідності перев’язувальний та шовний матеріал (шовк, кетгут), одяг, грунт, секційний матеріал (шматочки некротизованих тканин, печінки, селезінки). З метою попередження шкідливої дії кисню повітря на анаеробну мікрофлору тверді матеріали для дослідження краще брати у короткі пробірки, що герметично закриваються. Рідкі досліджувані матеріали можна набирати у шприц, на голку насадити гумовий корок і в такому вигляді транспортувати до лабораторії.
Мікробіологічна діагностика газової гангрени зводиться до виділення чистих культур збудників, їх ідентифікації на основі морфологічних, культуральних і біохімічних властивостей та визначення типів токсинів.
Бактеріоскопія є необхідним етапом для орієнтації в характері ранової мікрофлори. Для цього готують мазки-відбитки з уражених тканин, ексудату чи випоту, забарвлюють за Грамом або метиленовою синькою. Наявність у мазках великої кількості крупних грампозитивних паличок зі спорами чи капсулами (C.perfringens) або без них може служити ознакою можливого розвитку газової гангрени
З метою орієнтовної ідентифікації клостридій можна використати люмінісцентно-серологічний метод, коли мазки обробляють діагностичними флуоресцентими сироватками. За видом сироватки яка викликає специфічне світіння навколо оболонок бактерій під люмінесцентним мікроскопом, визначають вид збудника.
Бактеріологічне дослідження. Рідкі досліджувані матеріали сіють у нативному вигляді. Шматочки уражених тканин та інші щільні матеріали спочатку гомогенізують у фарфорових ступках з піском, добавляючи рівний об’єм ізотонічного розчину хлориду натрію. Будь-який матеріал розділяють на 2 частини; одну з них прогрівають 20 хв при 80 °С, другу не піддають термічній обробці. Обидві проби паралально висівають на спеціальні сердовища для культивування анаеробних мікроорганізмів.
Для первинного накопичення анаеробів широко використовують середовище Кітта-Тароцці. На ньому C. perfringens росте з інтенсивним помутнінням і бурхливим газоутворенням. Інші види утворюють помутніння і менше виділення газу або без нього (C. histolyticum ). При посіві на стерильне знежирене лакмусове молоко C. perfringens вже через 4-5 год викликає його звудження з утворенням цегляного кольору губчастого згустка, який газ підіймає на поверхню пептонізованої рідини.
Класичним середовищем для отримання ізольованих колоній є кров’яний цукровий агар Цейслера (до МПА додають 15% дефібринованої крові і 2% глюкози). Чашки з посівами вирощують в анаеростаті. На цьому агарі колонії основних збудників мають гладеньку дископодібну форму сіруватого кольору з рівними або бахромчастими краями і піднятим центром, оточені зоною гемолізу
На середовищі Вілліса-Хоббса (МПА з лактозою, індикатором нейтральним червоним, яєчним жовтком і знежириниь молоком) колонії C. perfringens червоного кольору і зоною опалесценції; колонії C. novyi, безбарвні (не розкладають лактози), але із зоною опалесценції; колонії С. septicum червоні; навколо колоній C. novyi на агарі (ферментують лактозу), але C. perfringens не мають райдужних вінчиків.
Колонії C. histolyiticum, С. sordellii, C. difficile безбарвні, а ореол опалесценції мають лише колонії C. sordellii. На кров’яному агарі з бензидином колонії C. novyi чорніють після перебування на повітрі ( рис. 4.)
При посіві матеріалу уколом у стовпчик агару Вільсона-Блера вже через 3-4 години в ділянках росту C. perfringens середовище чорніє. Харакерні особливості росту на молоці і середовищі Вільсона-Блера використовують для експрес-діагностики газової гангрени, викликаної C. perfringens.
Колонії, що виросли на диференціально-діагностичних середовищах, мікроскопують, пересівають на середовище Кітта – Тароцці, отримують чисту культуру й ідентифікують її за морфологічними, культуральними, і біохімічними властивостями
При відсутності анаеростатів та інших приладів для створення анаеробних умов ізоліовані колонії, а отже й чисті культури, можна отримати шляхом посіву різних розведень досліджуваного матеріалу у трубки Віньяль-Вейона за методом Вейнберга. Матеріал розводять 1:10, 1:100, 1:1000 у розтопленому і охолодженому до 45 °С цукровому агарі, розлитому в пробірки по 10 мл. Із кожного розведення агар натягують у трубки а капілярний кінець запаюють на вогні. Після інкубації при 37 °С трубки розпилюють надфілем, стовпчик агару з характерними колоніями анаеробів виштовхують у стерильну чашку Петрі. Потім колонії петлею пересівають у середовище Кітта-Тароцці, вирощують чисті культури й ідентифікують їх.
Використовують також сучасні апарати і тест-системи для культивування й ідентифікації анаеробів, а також бокси, де всі посіви, пересіви та інші маніпуляції проводять при повній відсутності кисню повітря.
Однак у рутинних бактеріологічних лабораторіях виділення і повну ідентифікацію чистих кудьтур проводять рідко, так як весь процес займає багато часу, вимагає складних і дорогих живильних середовищ та спеціальних приладів. У зв’язку з цим для більш швидкої діагностики анаеробної газової інфекції і вибору відповідних лікувальних антитоксичних сироваток проводять визначення типів екзотоксинів за допомогою реакції нейтралізації in vivo.
Біологічні дослідження. Для постановки тесту нейтралізації використовують видові діагностичні антитоксичні сироватки, центрифугати (фільтрати) бульйонних культур і білих мишей, масою 16-18 г. У 6 пробірок вносять по 0,9 мл центрифугату, потім у 5 з них добавляють по 0,6 мл антитоксичних сироваток до основних видів збудників (табл. 2 ). У 6-у пробірку вносять 6 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (контроль). Суміші витримують у термостаті протягом 40 хв і кожну з них в об’ємі 0,5 мл вводять внутрішньовенно двом мишам. Видову належність культури (токсину) визначають за мишами, що вижили, при загибелі тварин контрольної та інших дослідницьких груп.
У лабораторіях, де є можливості працювати з культурами тканин, реакцію нейтралізації ставлять на трипсинізованих клітинах 10-12 денних курячих ембріонів.
Токсигенність можна визначити ще на етапі росту ізольованих колоній. Для цього колонію емульгують на склі у краплі акридинового оранжевого, накривають покривним скельцем і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Наявність тільки зелених паличок свідчить про їх токсигенність. Червоні або зелені з червоними фрагментами бактерії виявляють при слабкій продукції токсинів або при повній їх відсутності.
Можна встановити вид і тип токсину в реакції преципітації на склі у агаровому гелі з фільтратом та відповідними антисироватками в реакції гальмування invitro специфічними антитілами лецитиназної чи лейкотоксичної активності фільтратів або ранових ексудатів.
Ще швидше і точніше встановлюють види збудників газової гангрени за допомогою газової хроматографії, яка дозволяє визначати їх за якісним і кількісним вмістом насичених і ненасичених жирних кислот.
Лікування і профілактика передбачають такі заходи: 1) хірургічну обробку ран; 2) раннє введення з профілактичною метою полівалентної антитоксичної очищеної або концентрованої сироватки «Діа-ферм-3» проти С. perfringens, С. novyi та С. septicum no 10 000 МО, з лікувальною метою дозу сироватки збільшують у 5 раз (по 50 000 МО кожного серовару); 3) застосування для боротьби з рановою інфекцією антибіотиків, антистафілококової плазми, антисгафілококового гамма-глобуліну.
Лікування тільки антитоксичною сироваткою в ряді випадків не дає потрібного ефекту, тоді як комплексне застосування антитоксичної сироватки й антибіотиків, які змінюють дисперсійні і дифузні властивості екзотоксинів, значно знижує летальність.
Профілактика псевдомембранозного коліту полягає у припиненні введення антибіотиків з селекціонуючими властивостями.
Як додаткові терапевтичні засоби застосовують оксигенотерапію, переливання крові, введення інгібіторів протеолітичних ферментів (протеаз), препаратів, які нормалізують обмін речовин.
Методи специфічної активної профілактики ще в стадії розробки.
Діагностику харчових токсикоінфекцій, викликаних C. perfringens типів А і С проводять за допомогою бактеріологічного дослідження з метою виділення збудника, визначення масивності контамінації ним харчових продуктів і типу токсинів.
Виділення чистих культур проводять так само, як і при анаеробній газовій інфекції (висів матеріалу на сереовища Цейслера, Вілліса-Хобса або в трубки Віньяль-Вейона, отримання ізольованих колоній, чистих культур, ідентифікація). При цьому обов’язково сіють10 мл крові хворого в 150-200 мл середовища Кітта-Тароцці з метою виділення C. perfringens. Із фільтратом культури важливо поставити реакцію нейтралізації на мишах для визначення типу екзотоксину.
Важливо провести і кількісний мікробіологічний аналіз. Для цього досліджуваний матеріал розводять у пептонній воді від 10 -1 до 10 -10 і по 1мл кожного розведення засівають у розтоплене і охолоджене до 45 °С середовище Вільсона-Блера. Через 6-8 год інкубації при температурі 45-46 °С (або 20 год при 37 °С) відбирають ті проби, в яких виросло 10-30 колоній, і обчислюють кількість бактерій в 1 мл посівного матеріалу, враховуючи ступінь розведення і посівну дозу.
Для швидкого виявлення C. perfringens досліджуваний матеріал сіють у пробірку з лакмусовим молоком. Через 4-5 год відбувається характерне утворення губчастого згустка і просвітлення сироватки.
Діагноз харчової токсикоінфекції встановлюють тоді, коли виявляють значне обсіменіння (10 6 і більше в 1 г) тих продуктів що спричинили захворювання, виділяють C. pergringens типів А і С і відповідні екзотоксини або ж висівають їх з крові хворого C. perfringens будь-якого серотипу ( A, B, C, D, E, F).
Діагностика псевдомембранозного коліту. C. difficile є частим нозокоміальним патогеном, який у 90-100 % випадків викликає це захворювання на фоні нераціональної терапії антибіотиками (ампіцилін, кліндаміцин, цефалоспорини). Вкаані препарати викликають глибокий дизбаланс мікрофлори кишечника і колонізацію слизової C. difficile. Бактерії продукують 2 види токсинів - ентеротоксин (токсин А) і цитотоксин (токсин В).
Лабораторний діагноз псевдомембранозного коліту потребує взяття псевдомембран при колоноскопії і виділення збудника з біопатів слизової оболонки сліпої кишки або випорожнень. C. difficile висівається майже від усіх хворих за допомогою тих же методів, що і при інших анаеробних інфекціях. “Золотим стандартом” є цитотоксичний тест: фільтрат фекалій або культури вносять у флакон з моношаром культури клітин, в результаті цього виникає цитопатична дія, що нейтралізується специфічною антисироваткою. На жаль, він досить громіздкий і забирає багато часу.
Швидка латекс-аглютинація застосовується часто, але вона не є високо- специфічною і часто дає хибно-позитвні і хібно-негативні результати. Більш точним і високоспецифічним є імуноферментний аналіз, який дає змогу надійно виявляти цитотоксин і ентеротоксин C. difficile .