2.5.4. Интерлейкин-36

Подсемейство IL-36, которое включает в себя три провоспалительных цитокина: IL-36α, IL-36β и IL-36γ, и специфический противовоспалительный цитокин - рецепторный антагонист интелейкина-36 (IL-36Ra), было открыто in silico при скрининге баз экспрессирующихся последовательностей [26], интерлейкины этой группы были клонированы и охарактеризованы тремя группами исследователей [80, 13; 42]. Так как биологическая активность трех агонистов данной группы обычно не различается, как и в случае с IL-1 для краткости принято писать просто IL-36, когда мы говорим о любом из агонстов IL-36α, IL-36β или IL-36γ. Различаются агонисты IL-36 не типом биологической активности, а клетками-источниками, значением аффинности к рецептору и особенностями процессинга.

Рецептор IL-36 включает в себя специфическую рецепторную субъединицу и корецепторную, общую с рецептором IL-1 и IL-33. Исследования показали, что все агонисты IL-36 подобно IL-1 активируют в клетках NF-κB, JNK, p38 и ERK1/2 пути внутриклеточной сигнальной трансдукции [85; 19]. Таким образом, чтобы выявить функциональную нишу цитокинов группы IL-36, отделив её от IL-1 следует в первую очередь обратить внимание на распространение и обилие на мембране IL-36R и IL-1R среди различных типов клеток. Самый высокий уровень экспрессии IL-36R был выявлен в коже, также заметный уровень был обнаружен в трахее, щитовидной железе, печени, почках и мочеточнике [85]. В дальнейшем были точнее определены группы клеток, несущие рецептор IL-36R: кератиноциты и клетки эпителия почечных канальцев, эпителиоциты бронхов и альвеол, фибробласты дермы и дыхательных эпителиев [19], синовиальные фибробласты и суставные хондроциты [50], адипоциты [6], моноциты и макрофаги [91], а также зрелые дендритные клетки моноцитарного происхождения и плазмоцитоидные дендритные клетки, но не миелоидные дендритные клетки 1-го и 2-го типов [57], микроглия ЦНС [8; 5]. Наличие этого рецептора характерно для CD4-положительных T-лимфоцитов мышей, особенно Th1 и Th2, на поверхности Th17 этот рецептор менее представлен [91; 14].

Для генов агонистов группы IL-36 показана экспрессия лишь в ограниченном числе тканей и популяций клеток, обнаруживающая их преимущественную локализацию в эпителиях, при этом нет четкого разделения, часто при повышении экспрессии одного из трех агонистов, экспрессия двух других также повышена, но несколько ниже. Высокий уровень экспрессии гена IL36G найден в дифференцирующихся эпидермисе кожи, причем именно в кератиноцитах, но не фибробластах, эндотелиоцитах или меланоцитах [80]. Гиперэкспрессия гена IL36G в эпидермисе обнаруживается в участках протекания реакции гиперчувствительности, а также в очагах псориатического воспаления. Для некоторых популяций клеток иммунной системы также характерна экспрессия гена IL36G, например, его экспрессируют моноциты и макрофаги, особенно инфильтрирующие псориатические бляшки, а также некоторые типы дендритных клеток. Интересно, что зрелые дендритные клетки способны к конститутивной экспрессии IL36G. Экспрессия IL36A характерна для активированных кератиноцитов, особенно в области псориатических бляшек, эпителиальных клетках эндотелия дыхательных путей больных астмой или аллергическими заболеваниями. Доминирующая экспрессия IL36B характерна для клеток почечных канальцев, синовиальных фибробластов и хондроцитов суставов, в которых уровень мРНК поддерживается конститутивно. [26, 84, 38,80].

Провоспалительные цитокины, такие как TNFα, IL-17, IL-1β, IFN-γ вызывают экспрессию генов агонистов IL-36 в клетках эпителия бронхов [19], кератиноцитах. [14] Лиганды различных TLR также влияют на экспрессию этих генов. Особенно эффективными индукторами являются LPS, флагеллин и двуцепочечная РНК (dsRNA) или её синтетический аналог полиинозин-полицитидиловая кислота (pI:C) и флагеллин [45].

В отличие от генов агонистов IL-36, экспрессия гена рецепторного антагониста IL36RN наблюдается в более широком спектре тканей и органов. В первую очередь, это также кожа. Экспрессия IL36RN имеет конститутивный характер в кератиноцитах, и мРНК этого гена обнаруживается и в нормальной коже, однако, в псориатических бляшках этот уровень выше. [9]. Также, IL36RN экспрессируется в мозге, тимусе и почках. Во всех органах экспрессия гена IL36RN преимущественно локализуется в эпителиальных клетках, либо клетках макрофагального типа (моноциты, дендритные клетки макрофагального происхождения, микроглиальные клетки) [80]

Как и остальные члены семейства, агонисты IL-36 транслируются в виде неактивных предшественников. Однако, замечательная особенность этой группы состоит в том, что их процессинг осуществляется не каспазой-1, а какими-то другими, до сих пор не определенными протеазами. Исследователям сейчас даже не известно, какова длина активированных форм агонистов IL-36 в физиологическом состоянии. На данный момент приходится пользоваться формами укороченными генноинженерными способами, для которых была показана наибольшая биологическая активность в теста in vitro. В частности, укороченный вариант rhIL-36γ/S18, в котором отсутствуют первые 17 аминокислот, показал биологическую активность в 1500 раз больше, а аффинитет его к рецептору был почти на 3 порядка выше, чем у полноразмерного непроцессированного варианта. [86] Именно эта форма, укороченная на 17 первых аминокислот и использовалась in vitro большенством исслеователей в течение последних 5 лет. И это очень важный вопрос, так как мы до сих пор доподлинно не знаем, какая именно биологичская активность характерна для физиологически процессированного IL-36γ, возможно она in vivo ниже. По поводу особенности активации белков данной группы следует добавить еще одно соображение. Рецепторный антагонист IL-36 для осуществления высокой ингибирующей активности не требует отщепления больших пропептидных фрагментов, этот цитокин активен в полноразмерном состоянии. Действие него действие кандидатных протез для активации IL-36γ, например нейтрофильной эластазы, приводит к потере им ингибирующей активности. Таким образом, можно предположить особый способ регуляции баланса агонист/антагонист, характерный для этой группы. В нормальном состоянии, без привлечения в очаг воспаления нейтрофилов, даже в случае разрушения кератиноцов и выхода из них IL-36γ, он будет легко подавлен высоким ингибирующим действием IL-36Ra. Однако, в случае, когда в ткани уже произошло привлечение и дегрануляция нейтрофилов с выходом их протеаз в межклеточное вещество, баланс сил сильно меняется: расщепленный антагонист дезактивируется, а для активности агониста такое действие, наоборот, будет стимулирующим.

С выявлением паттерна экспрессии гена рецептора IL36R стало известно, какие клетки должны отвечать на его воздействие. Так, синовиальные фибробласты и хондроциты суставов в ответ на IL-36 экспрессируют TNFA и IL1B [50]. Фибробласты бронхов экспрессируют TNFA и IL1B, IL6, хемокины: CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL3, CCL-20, CCL2, CCL5, CXCL10, гемопоэтические факторы: GCSF, GMCSF [19]. При стимуляции кератиноцитов эпидермиса и фибробластов кожи наблюдалось увеличение экспрессии TNFA и IL1B, ССL20, самого IL36G, а также индукция экспрессии NOS2, DEFB4, DEFB103B, MMP2 [7; 38]. Интересным оказалось действие этого цитокина на дендритные клетки макрофагального и плазмоцитоидного происхождения: кроме индукции экспрессии IL-1β, IL6, CCL1, CXCL1, IL1A, TNFA, GMCSF, IL23P19, IL12P40, IL12P35 была отмечена гиперэкспрессия генов молекул непосредственно задействованных в процессе презентации антигенов: HLA-D, B7.1 и B7.2, причем действие IL-36 было в данном случае сильнее и специфичнее, чем действие IL-1, то есть IL-36 является цитокиновым фактором созревания дендритных клеток. Важные данные были получены при исследовании CD4-положительных Т-лимфоцитов мышей (для Т-лимфоцитов человека наличие IL-36R не характерно). Дело в том, что на мембранах Т-лимфоцитов различных субпополяций в процессе поляризации доминируют рецепторы различных представителей семейства интерлейкина-1. Так, для поляризованных Тh1 характерно наличие рецептора IL-18, для Тh2 – рецептора IL-33, а для Th17 рецептора IL-1. Причем, данные цитокины сами стимулируют соответствующее направление поляризации, коммитируя Т-лимфоцит к восприятию только этого цитокина. Так вот, оказалось, что рецептор IL-36R присутствует в первую очередь на наивных Т-лимфоцитах, а потому его действие на культуры поляризующихся Т-лимфоцитов увеличивает экспрессию генов, кодирующих характерные для каждой субпопуляций цитокины: IFN-γ для Th1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-3 для Th2, IL-17 и IL-23 для Th17. Такой эффект объясняется в первую очередь положительным влиянием IL-36 на IL-2 – фактор пролиферации Т-лимфоцитов. Вдобавок к косвенному пролиферативному действию IL-36 через индукцию IL-2, было показано и его поляризующее действие: IL-36β в сочетании с IL-12 синергично действует на поляризацию в Тh1-напралении, в еще большей мере, чем IL-18 [90; 91]. Несмотря на то, что влияние IL-36 на Т-лимфоциты человека, по всей видимости, может быть только непрямым, было показано поляризационное влияние в случае, если посредниками IL-36 выступают дендритные клетки, которые культивировались в его присутствии [Маtumba S. et al., 2012].

Обнаружено наличие между IL-36 с одной стороны и IL-1β, TNFα и IL-17 с другой, положительной обратной связи коэкспрессии, так называемой петли взаимной костимуляции экспрессии, нарушения регуляции которой причастны, по-видимому, к хронизации воспаления при псориазе [70, 38, 14]

Самой явственной патологией, связанной с дисрегуляцией IL-36 является псориаз. Псориаз – это комплексное заболевание, характеризующееся как хроническое воспаление кожи с участием адаптивного иммунитета в виде Th17 и Th1, при котором вследствие нарушения цитокинового окружения кератиноцитов, нарушается их деление и дифференцировка. IL-36 способен участвовать во многих звеньях патологического процесса псориаза: от аутокринной индукции в кератиноцитах самого IL-36, активации выделения β-дефенсинов 2 и 3, кателецидина LL37, антимикробного пептида псориазина - S100A7 и провоспалительных цитокинов [38, 14], хемокинов для дендритных клеток [17] и T-лимфоцитов [84], до стимуляции процесса созревания пДК [57] и направления дифференцировки T-лимфоцитов по Th1 пути [90] и в меньшей степени Th17-пути [91].

Кроме того, что действие IL-36 in vitro логично вписывается в схему развития патологии псориаза, есть ещё несколько причин, указывающих на роль IL-36 в регуляции воспаления в коже и паталогическом процессе псориаза. Результаты недавнего сравнительного исследования позволяют сказать, что как повышенный уровень экспресии IL36G, так и повышенные уровень IL-36γ в коже и сыворотке является отличительной чертой именно псориатического воспаления, в отличие от апотического дерматита или контантной экземы. Эти уровни хорошо кореллируют с тяжестью забоелвания и их можно использовать как биохимические маркеры выявления псориатической эритродермии на ранних стадиях. [20]

Важные доказательства роли IL-36 в патогенезе псориаза появились после создания и изучения модели индуцированного псориазоподобного фенотипа у мышей [9]. Были созданы несколько линий трансгенных мышей с искусственно повышенной экспрессией IL-36α в коже. Эта линия имела фенотип кожи близкий к псориатическому: локальные язвы с повышенной инфильтрацией иммунных клеток, нарушениями дифференцировки кератиноцитов, а также гиперэкспрессей генов многих белков, ассоциированных с воспалением. Скрещивания таких трансгенных мышей с четырьмя другими линиями мышей: с линией, дефектной по гену, кодирующему рецептор к IL-36; с линией с дефектом в гене, кодирующем рецептор к IL-1; с линией с дефектом в гене, кодирующем рецептор к TNF-α; с линией, дефектной по IL36RN; с линей с дефектом в гене RAG-2, показало, что ни IL-1β, ни TNFα не имеют критического значения в протекании этого псориазоподобного заболевания у мышей, в то время как отсутствие рецептора к IL-36 приводило к восстановлению у мышат с генотипом IL-36Atg⁺ x IL-1RR2^- нормального фенотипа кожи. Линия мышей, которая имела дефекты в гене антагониста IL-36Ra, обнаруживала более драматичные последствия такого изменения: из 109 мышат этой линии выжил только один.

В-третьих, были выявлены несколько вариантов мутаций в гене, кодирующем рецепторный антагонист IL-36 (IL-36Ra), которые четко ассоциированы со случаями тяжелой, опасной для жизни формы псориаза – генерализованного пустулярного псориаза (GPP). [53; 64; 29, 27]. Это также косвенно подтверждает важность IL-36-опосредованных ответов в этиологии этого заболевания.

Недавнее исследование [81] обнаружило, что снижение активации Notch-сигнального каскада, которое характерно для кератиноцитов в зонах ранений, приводит к повышению экспрессии IL36A и накоплению IL-36α в клетках in vitro и in vivo.. Очевидно, преднакопление IL-36 в клетках регенерирующего эпидермиса готовит их к быстрой активации в условиях ранения. Здесь интересно будет напомнить о существовании феномена Кёбнера, который заключается в появлении свежих очагов воспаления на месте ранения здоровой кожи у больных псориазом. Можно предположить, что в данном случае имеет место быть описанная выше регенеративная продукция IL-36 в кератиноцитах и именно она является спусковым крючком воспаления.

Таким образом, можно предположить, что IL-36 – это группа провоспалительных цитокинов, локализующийся и осуществляющий свои функции эпителиях, участвующий в рекрутинге и активации клеток врожденного и приобретенного иммунитета, а также инициации Тh-1-опосредованных ответов, и является, по-видимому, маркером пироптотического разрушения клеток.