2.2. Гены семейства il-1

Гены всех представителей семейства интерлейкина-1, за исключением IL-18 [60] и IL-33 [74], компактно локализованы в пределах одного кластера генов, протяженностью около 300 тысяч пар нуклеотидных оснований на длинном плече второй хромосомы (2q13). [59]

Клонирование кодирующих последовательностей IL-1α и IL-1β человека было впервые осуществлено еще 80-х годах [93, 51]. На данный момент клонированы и характеризованы все гены представителей этого семейства. Исследование устройства их генов показало высокую степень консервативности распределения, структуры и числа экзонов в генах этих белков. Анализ нуклеотидных последовательностей генов IL-1F выявил существование трёх “общих” кодирующих экзонов (common exons, CE), наличие которых характерно для большинства генов IL-1F, соответствующих главной глобулярной части белковой молекулы после процессинга (смотри далее) и фолдинга. Так, экзон CE1 кодирует три первых β-складчатых консервативных мотива от S1 до S3, CE2 – кодирует S4, S4, S6, и почти весь S7, а CE3 соответствует участкам β-складок с S8 до S12 [59]. Таким образом, молекулы членов семейства IL-1 содержат 12 β-складчатых консервативных участков и гибкие петли между ними [26]. Именно эта трехмерная структура белка, важная для рецепции лиганда, получившая название β-трилистника, характеризует структурно всех представителей IL-1F.

2.3. Структура молекул il-1f и важнейшие молекулярные детерминанты рецепции

Важно упомянуть, что все представители семейства IL-1 транслируются в виде неактивного предшественника. Для их активации требуется протеолитическое пострансляционное отщепление пропептидных участков различными протеазами (в основном, это провоспалительные каспазы, но бывает иначе, о чём ниже). При этом следует заметить, что эти пропептидные фрагменты не являются сигнальными участками и не участвуют в направлении транслируемого белка по пути канонического везикулярного транспорта или другого типа внутриклеточной транслокации. Именно зрелые молекулы с процессированными пропепдидными фрагментами изучаются структурно. Как уже говорилось, молекулы представителей этот семейства имеют в своем составе 12 бета-складчатых участков, образующих 3 группы по 4 бета-складки. Эти молекулы могут быть как стабилизированы дисульфидными связями, так и не иметь оных в составе, в них отсутствуют ионы металлов, часть из этих белков подвергается посттрансляционному гликозилированию.

Для целей современной белковой инженерии (рациональный дизайн улучшенных по сравнению с природными антагонистов) чрезвычайно важными являются подробные данные не просто о кристаллической структуре молекул интереса, но скорее о молекулярной структуре комплексов лигандов с рецепторами, в подробностях конкретных межатомных взаимодействий. Поэтому, структура комплексов лигандов семейства интерлейкина-1 с их рецепторами изучается в последнее время очень подробно. На данный момент с помощью методов РСА и ППР изучены структуры и рецепторные детерминантны этих интерлейкинов [40, 76, 47, 89]. Несмотря на большое структурное сходство между цитокинами этого семейства, вплоть до одинаковых аминокислотных остатков в консервативных участках, результаты этих исследований говорят о том, что конкретные межатомные взаимодействия, отвечающие за рецепцию агонистов и антагонистов различных групп цитокинов этого семейства различаются. Рассмотрим для примера молекулярные детерминанты взаимодействия с рецепторами агонистов и антагонистов IL-1 и IL-36. Кристаллические структуры тройного комплекса IL-1R/IL-1β/IL-1AcP показывают, что рекрутирующее корецепторную субъединицу взаимодействие происходит посредством комбинированной молекулярной поверхности как лиганда, так и конформационно изменившегося первичного рецептора. Основные области лиганда, опосредующие взаимодействие с AcP: петля между 4 и 5 β-складками (β4/5), петля между 11 и 12 β-складками (β11/12). Именно в этих областях в молекулах-агонистах присутствуют аминокислотные остатки с отрицательно-заряженными боковыми цепями (Asp54 в β4/5, Asp145 в β11/12), которые образуют стабилизирующие водородные связи с боковыми цепями аминокислотных остатков (Arg286, Ser185, соответственно) в составе корецепторной субъединицы. На аналогичных позициях в молекуле-антагонисте (IL-1Ra) присутствуют аминокислотные остатки с положительно-заряженными боковыми цепями (Lys145 β11/12), либо петля не имеет достаточной длины (β4/5), что предотвращает стабильное крепление корецептора к лиганду. [83; 92]. Результаты исследования кристаллической структуры IL-36γ и IL-36Ra с помощью рентгеноструктурного анализа показали, что оба цитокина имеют типичную для IL-1F структуру бета-трилистника и похожи по структуре на свои функциональные аналоги. При сравнении молекулярных архитектур IL-36γ и IL-36Ra оказалось, что именно в областях β4/5 и β11/12 эти цитокины обнаруживают наибольшее конформационное различие, это, на первый взгляд, подтверждало предполагаемую до того концепцию о единообразии механизма рецепции IL-1 и IL-36. Однако, если углубиться в детали взаимодействий, всё окажется гораздо сложнее. Во-первых, в конформационных позициях, в которых в IL-1β присутствуют отрицательно-заряженные аминокислотные остатки, в IL-36γ находятся либо незаряженная аминокислота (Ala162 в β11/12), либо (Arg71 в β4/5) заряженная боковая цепь уже занята созданием связи внутри молекулы IL-36γ. Более того, IL-36Ra в позиции, в которой следовало бы ожидать аминокислоту с положительно заряженной боковой цепью, имеет отрицательно заряженную (Asp148), из-за чего изначально у него предполагалась агонистическая активность [26]. Во-вторых, при создании химерных молекул, у которых различным образом комбинировались β4/5-петли и β11/12-петли со структурой, характерной для антагониста и агониста, выяснилось следующее. При интродукции “агонистических” петель в антагонист, происходила потеря им антагонистической активности и приобретение хоть и слабого, но активирующего действия. В то время как превращение агониста в антагонист при обмене его петель на “антагонистические” не происходило. Говоря короче, несмотря на то, что архитектура взаимодействия рецепторов и лигандов IL-1 и IL-36 очень похожа, частности взаимодействия при рецепции IL-36 и IL-1 значительно отличаются [26; 33].