1. Методи досліджень

1.1. Метод виділення вірусу. Сутність методу полягає у виділенні вірусу на ембріонах курей і подальшої його ідентифікації.

Апаратура, матеріали і реактиви. Термостат з температурою нагріву 37‑38 ^оС; центрифуга з частотою обертів 3000; центрифужні склянки ємкістю 50‑100 см³; ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,1 г, подрібнювач тканин; овоскоп; колби конічні скляні ємкістю 10, 15, 20 см³, піпетки пастерівські або піпетки скляні вимірювальні ємкістю 1, 2, 5 і 10 см³; ступка фарфорова; скло кварцове; натрій хлористий 0,8 % або інші дезінфікуючі засоби; натрій лимонно-кислий 3-х заміщений 5 % розчин; йод 5 % розчин; антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин; середовища живильні МПБ і МПА; парафін; ембріони курей 9‑10 добового віку.

Еритроцити курей на фізіологічному розчині 0,7 і 1 % суспензія, для приготування якої кров відбирають у птиці або курей у віці 6 міс з підкрильцевої вени в колбу з фізіологічним розчином у рівних об’ємах із розчином лимонно-кислого натрію.

Отриману кров тричі відмивають фізіологічним розчином, еритроцити осаджують центрифугуванням з частотою обертів 1500 упродовж 10 хв. З осаду еритроцитів готують 0,7 або 1 %‑ву суспензію на фізіологічному розчині та зберігають не більше 5 діб за температури 4 °С.

Підготовка до дослідження. Спочатку проводять обробку органів патологічного матеріалу. Для цього патологічний матеріал стерильно виймають з гліцеринового розчину, трикратно ополіскують стерильним фізіологічним розчином і гомогенізують за допомогою подрібнювача тканин або подрібнюють в ступці з кварцовим склом. Гомогенат розводять 1 : 10 стерильним фізіологічним розчином і центрифугують з частотою обертів 1500‑2000 упродовж 15 хв. Супернатант переносять в стерильні пробірки, додають 1000 од / см³ стрептоміцину і витримують за кімнатної температури 60 хв.

Проведення дослідження. Для дослідження однієї проби матеріалу (надосадкова 10 %‑ва суспензія) заражають не менше 10 ембріонів. Перед зараженням ембріони попередньо овоскопують, відзначаючи кордон пуги і ділянку між кровоносними судинами для проколу шкаралупи з метою інокуляції дослідного матеріалу. Шкарлупу з боку пуги і місце проколу дезінфікують розчином йоду та фламбують. У центрі повітряного простору і в місці введення дослідного матеріалу роблять пробійником отвір, потім через бічний отвір вводять 0,2 см³ дослідного матеріалу на глибину 2‑3 мм в алантоїсну порожнину. Одночасно роблять висів по 0,2 см³ на поживні середовища МПБ і МПА, які поміщають в термостат за 37‑38 °С. Контролем служать 5 незаражених ембріонів. Після зараження ембріонів отвір у шкарлупі заливають парафіном. Заражені і контрольні ембріони інкубують в термостаті упродовж 24‑96 год. за температури 37‑38 °С і відносній вологості 60‑70 %. У процесі інкубації ембріони овоскопують два рази на добу, загиблі - зберігають в холодильнику за 4 ^оС. Через 96 год. інкубації всі ембріони скривають після попереднього охолодження в холодильнику за 4 ^оС упродовж 10‑12 год.

Перед оглядом ембріонів шкаралупу обробляють йодом і фламбують, та з кожного ембріона окремо збирають екстраембріональну рідину в стерильні пробірки, які висівають на МПБ і МПА та перевіряють на гемаглютинацію (РГА). Реакцію ставлять на склі шляхом змішування рівних крапель екстраембріональної рідини з 1 %‑вої суспензією еритроцитів курей. За негативної РГА зразки екстраембріональної рідини в кількості 1‑2 см³ від кожного зараженого ембріона (не менше 5 ембріонів) об'єднують і знову заражають не менше 10 ембріонів.

Виділення вірусу проводять упродовж 3-х пасажів на курячих ембріонах, перевіряючи в кожному пасажі екстраембріональну рідину на наявність гемаглютиніну в крапельної РГА. Якщо титри гемаглютиніну низькі, проводять ще 2‑3 додаткових пасажів.

Обробка результатів. Результат дослідження проби патологічного матеріалу вважають негативним, якщо в трьох додаткових пасажах не буде виявлено гемаглютинації еритроцитів. За наявності гемаглютинації еритроцитів проводять ідентифікацію виділеного вірусу.

1.2. Метод постановки реакції гемаглютинації. Сутність методу полягає в здатності вірусу грипу птиці аглютинувати еритроцити курей.

Апаратура, матеріали і реактиви - додатково мікротитратор типу Такачі або аналогічний; мікропіпетки; панелі з плексигласу.

Проведення дослідження. Готують дворазові розведення вірусутримуючого матеріалу (супернатант), отриманий після обробки патологічного матеріалу від 1 : 2 до 1 : 1024. Для цього в ряд лунок панелей з плексигласу додають фізіологічний розчин в об’ємі по 0,2 см³. У першу лунку вносять 0,2 см³ вірусу, троєкратно піпетують і переносять 0,2 см³ в другу лунку і так далі до необхідного розведення. З останньої лунки 0,2 см³ видаляють в дезінфікуючий розчин. У кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії курячих еритроцитів. Панелі струшують і залишають за кімнатної температури на 30 хв.

Контролем служать дві лунки з еритроцитами і фізіологічним розчином у рівному об’ємі по 0,2 см³ кожного. Реакцію гемаглютинації і реакцію затримки гемаглютинації (РЗГА) ставлять також з використанням мікротитратору або мікропіпеток в об’ємі 0,025 см³ у плексигласових панелях з лунками з 0,7 %‑вою суспензією еритроцитів.

Обробка результатів. Наявність на дні і стінках лунок осаду еритроцитів у вигляді перевернутої до гори «парасольки» свідчить про позитивну РГА. За негативної реакції в досліді і контролі еритроцити утворюють на дні лунки диск («ґудзик») з рівними краями.

Титром вірусу вважають певне його розведення, за якого спостерігається повна аглютинація еритроцитів, що відповідає одній аглютинуючій одиниці (1 АО).

1.3. Метод ідентифікації вірусу. Сутність методу полягає у здатності специфічних антитіл нейтралізувати гемаглютинуючу активність вірусу в реакції затримки гемаглютинації зі специфічними грипозними сироватками.

Апаратура, матеріали і реактиви - додатково набір сухих інактивованих антигенів вірусу грипу тринадцяти серологічних варіантів і гіперімунних сироваток для діагностики грипу птиці; апарат Кіппа; водяна баня; крейда або мармур; кислота соляна 30 %.

Проведення дослідження. Після визначення титру дослідного вірусу в кількісної РГА ставлять РЗГА. Спочатку встановлюють робочу дозу вірусу (4 АО), для чого вірус розводять фізіологічним розчином у стільки разів, скільки залишається від ділення на 4 значення гемаглютинуючого титру вірусу.

Наприклад: якщо титр вірусу 1 : 256, то робоче розведення буде 256 : 4 = 64, тобто в 0,2 см³ розведеного 1 : 64 вірусу буде міститися 4 АЕ. Для його приготування в даному прикладі відбирають 63 см³ фізіологічного розчину і 1 см³ вихідного вірусу.

Перед постановкою основного досліду перевіряють правильність вибору 4 АЕ. Для цього на панелі в чотири лунки наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину, потім у першу лунку додають 0,2 см³ фізіологічного розчину, потім в першу лунку додають 0,2 см³ 4 АЕ вірусу і після піпетування 0,2 см³ переносять в другу лунку, потім в третю і так далі. З четвертої лунки 0,2 см³ розведеного вірусу видаляють в дезінфікуючий розчин. Таким чином, в першій лунці має бути 2 АЕ, у другій 1 АЕ, в третій ‑ 0,5 АЕ, в четвертій ‑ 0,25 АЕ. Після цього в кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів. Панель струшують і залишають на 30 хв. за кімнатної температури. За правильного визначення робочої дози (4 АЕ) у першій і другій лунках повинна бути повна аглютинація, в третій ‑ часткова аглютинація, в четвертій ‑ чітко виражений диск («ґудзик») осілих еритроцитів.

Якщо в третій лунці виявляється повна аглютинація, то це означає, що обрана доза вірусу містить не 4 АЕ, а більше. У цьому випадку доза повинна бути зменшена. І навпаки, відсутність аглютинації в другій і частково в третій лунках свідчить про недостатність вірусу. Збільшують або зменшують робочу дозу, додаючи відповідно вірус або фізіологічний розчин і потім повторно перевіряють правильність вибору 4 АЕ.

Для постановки основного досліду в ряд лунок, починаючи з другої, наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину. Потім в першу і другу лунки додають по 0,2 см³ специфічної сироватки. У другій лунці суміш піпетують і переносять 0,2 см³ у третю лунку і так далі до необхідного розведення. Після цього в усі лунки вносять по 0,2 см³ робочого розведення вірусу (4 АЕ). Панелі струшують і після 30-хвилинного контакту сироватки з вірусом в кожну лунку додають по 0,4 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів.

Для точності обліку РЗГА ставлять контроль:

- сироватки (0,2 см³ + 0,2 см³ фізіологічного розчину і 0,4 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів);

- еритроцитів на спонтанну аглютинацію (0,2 см³ фізіологічного розчину ± 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів).

Обробка результатів. РЗГА вважають позитивною, а ідентифікацію вірусу завершеною, якщо специфічна сироватка гальмує гемаглютинуючу активність вірусу не менш ¼ ‑ ⅛ титру, вказаного на етикетці ампули (флакона).

1.4. Метод виявлення специфічних антитіл. Сутність методу полягає у виявленні специфічної здатності антитіл сироватки крові хворої і перехворілої птиці пригнічувати гемаглютинуючу активність вірусу в РЗГА. З цією метою досліджують не менше 20 проб сироватки крові від кожної групи дослідної птиці.

Апаратура, матеріали і реактиви ‑ додатково гліцерин; сухий лід.

Підготовка до дослідження. Дослідні сироватки попередньо розводять у співвідношенні 1 : 5 дистильованою водою. Для видалення термолабільних інгібіторів сироватки прогрівають на водяній бані за 60 °С упродовж 30 хв. В ампули (флакони) з антигенами додають фізіологічний розчин (рН 7,2‑7,4) згідно «Настанови по застосуванню набору антигенів і сироваток для діагностики грипу птиці».

Проведення дослідження. Спочатку готують двохкратне розведення сироватки на фізіологічному розчині, починаючи з розведення 1 : 5. Далі ставлять РЗГА.

При виявленні в сироватці крові титрів антитіл 1 : 10 і вище, її звільняють від неспецифічних термостабільних інгібіторів з метою підтвердження наявності специфічних антитіл до вірусу грипу. Для видалення термостабільних інгібіторів через розведену і прогріту сироватку крові пропускають вуглекислий газ з апарату Кіппа або додають шматочки сухого льоду. Обробку сироватки ведуть упродовж 2‑3 хв. Осад видаляють центрифугуванням упродовж 10 хв. з частотою обертів 1500. Надосадкову рідину досліджують у РЗГА.

Обробка результатів. Титром антитіл у сироватці вважають її останнє розведення, що дало повну затримку гемаглютинації з дослідним антигеном.

Виявлення титру антитіл 1 : 10 і вище, але не менше, ніж у 30 % дослідної сироватки є підставою для постановки діагнозу, який повинен бути підтверджений позитивними результатами вірусологічних досліджень.

1.5. Метод ретроспективної діагностики. Сутність методу полягає у виявленні достовірного приросту рівня специфічних антитіл, обумовленого природним розвитком грипозної інфекції в організмі зараженої птиці.

Проведення досліджень. Досліджують парні сироватки, отримані в перші 1‑2 доби на початку захворювання і через 4‑10 діб після першого відбору крові. Сироватку крові звільняють від інгібіторів. РЗГА ставлять з виділеним вірусом або з антигенами діагностичного набору з урахуванням епізоотичної обстановки щодо циркуляції того чи іншого серологічного варіанту вірусу грипу.

Обробка результатів. Чотирьох кратне і більше збільшення титрів антитіл у парних сироватках є підставою для встановлення позитивного діагнозу.