Участие тромбоцитов в гемостазе

Механизмы участия лейкоцитов и особенно эритроцитов п образовании тромба еще недостаточно изучены. Среди клеток крови, участвующих в гемо­стазе, лучше всего изучены изменения, происходящие в тромбоцитах, состав­ляющих основную массу первичного тромба.

Тромбоциты, или кровяные пластинки, образуются в результате фрагмен­тации мегакариоцитов костного мозга и представляют собой безядерные фраг­менты их цитоплазмы. Тромбоциты способны к выполнению таких фундамен­тальных клеточных реакций как продукция энергии, секреция и сократимость. На поверхности тромбоцитов или во внутренних гранулярных фракциях со­держится целый ряд факторов свертывающей и фибринолитической систем. Тромбоциты являются и основными участниками первичного гемостаза.

Эффективный первичный гемостаз представлен тремя основными этапами (рис.10): 1) адгезия (прилипание) тромбоцитов; 2) активация тромбо­цитов и секреция; 3) агрегация тромбоцитов (склеивание тромбоцитов друг с другом).

1.Адгезия тромбоцитов. Пусковым моментом адгезии тромбоцитов является повреждение эндотелия сосудистой стенки. Уже в первые секунды после трав­мы тромбоциты прилипают к краям поврежденного эндотелия и коллагеновым волокнам субэндотелия. Адгезия тромбоцитов на сосудистой стенке осуществ­ляется с участием адгезивных белков (фактор Виллебранда, фибриноген, тромбоспондин, фибронектин) и ионов кальция. Важную роль в адгезии тромбоци­тов и стимуляции их гемостатической функции играет фактор Виллебранда — гликопротеин с мол.массой более 200000, синтезируемый эндотелиоцитами и мегакариоцитами (клетками-предшественниками тромбоцитов). Фактор Вил­лебранда связывается с тромбоцитарными рецепторами (ГП IЬ и ГП IIЬ/IIIа), выполняя роль связующего звена между тромбоцитом и коллагеном субэндотелия.

При наследственном дефекте (дефиците фактора Виллебранда (болезнь Виллебранда) или гликопротеина Ib (синдром Бернара-Сулье)) процесс адгезии тромбоцитов нарушается.

С рецепторами IIb/IIIa связываются и фибриноген, тромбосподин, фибронектин, причём наибольшая аффинность у этих рецепторв отмечена к фибриногену (рис. 11). Эти рецепторы эксперессируются на поверхности тромбоцитов только после их активацию

Связывание фактора Виллебранда с ГП Ib приводит к повышению внутриклеточной концентрации Са2+ в 2-3 раза (открываются кальциевые каналы плазматической месбраны тромбоцитов и Са2+ из плазмы крови идет в цитоплазму, ч то вызывает конформационные изменения в мембране и эксперссию ГП IIb/IIIa на плазматический мембране тромбоцитов. Увеличение уровня Са²⁺ в цитоплазме ведет и к активации тромбоцитов.

Процесс адгезии тромбоцитов совершается быстро и обычно завершается уже в первые 3-10 с после повреждения сосуда. Адгезия тромбоцитов удержи­вает их на поверхности стенки сосуда, предохраняя от смыва в кровь при кро­вотоке. После фиксации тромбоцитов на субэндотелиальных структурах они очень быстро теряют свою дисковидную форму и распластываются на сосуди­стой стенке.

2.Активааяя тромбоцитов и секреция. Неактивированные тромбоциты на­поминают двояковыпуклые диски (2-4 мкм в диаметре), циркулируют в крови и обычно не адгезируются к сосудистой стенке, друг к другу и к другим клеткам крови. В ходе тромбообразования вовлекаемые тромбоциты активируются.

Активация тромбоцитов — это ряд процессов, которые включают из­менение формы тромбоцитов, увеличение их подвижности и сопровождаю­щиеся высвобождением содержимого их гранул. Активация и секреция тром­боцитов регулируется изменением в цитоплазме уровня циклических нуклеотидов, изменением концентрации ионов кальция, гидролизом мембранных фосфолипидов (фосфатидилинозитола и фосфорилированием определенных внутриклеточных белков (рис. 12).

Тромбин и коллаген— наиболее важные внешние факторы активации тромбоцитов. Тромбин — более мощный индуктор агрегации тромбоци­тов, активирующий тромбоциты по фосфатидилинозитольному механизму. Связывание тромбина со специфическим рецептором на плазматической мем­бране сопровождается активированием фосфолипазы С. Этот фермент гидро-лизует мембранный фосфолипид фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат до двух биологически активных молекул — диацилглицерола и инозитолтрифосфата.

Диацилглицерод активирует Тротеинкиназу С, которая в свою очередь в цитоплазме фосфорилирует специфический протеин (м.м. 47000)_, контролирующий секрецию гранул тромбоцитов (α-гранулы содержат антигепариновый фактор, β-тромбоглобулин, тромбоцитарный фактор роста, фибриноген, фибро-нектин, альбумин, фактор Виллебранда, тромбоспондин, а₂-антиплазмин, кал-ликреин и др.: Плотные гранулы (5-гра^нулы — АДФ, АТФ. Са2+, ГДФ, ГТФ, Ф_н ,серотонин. адреналин и др.; лизосомы (ферментные гранулы —кис­лые гидролазы и др).

Инозитолтрифосфат мобилизует Са²⁺ из плотных гранул (или цистерн эн-доплазматического ретикулума), который в цитоплазме связывается с кальмодулином и активирует специфическую киназу. что сопровождается фосфори­лированием легких фибрилл миозина. Эти фибриллы затем взаимодействуют с актином и образуется актомиозин (тромбостенин). способный сокращаться, что увеличивает подвижность тромбоцитов и их способность изменять форму.

Увеличение уровня ионов кальция в цитоплазме тромбоцитов индуциру­ет и перестройку плазматической мембраны (осуществляется флип-флоп пере­ход фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина из внутреннего во внешний липидный монослой; Са²⁺ также стабилизирует кластеры фосфатидилсерина за счет связывания с ним и хелатные комплексы , превращая ее в матрицу для взаимоориентированного связывания и активирования факторов свертывания крови).

Изменение под действием Са²⁺ структуры липидного бислоя плазматиче­ской мембраны тромбоцитов усиливает и экспрессиию рецепторов IIЬ/IIIа на по­верхности тромбоцитов.

Увеличение уровня ионов кальция в цитоплазме сопровождается и активированием фосфолипазы А₂ (ФЛ А₂). ФЛ А₂, гидролизуя фосфолипиды плаз­матической мембраны, приводит к высвобождению жирных кислот, преиму­щественно арахидоновой кислоты, используемой как субстрат в синтезе тромбоксана А₂ (рис.13).

Коллаген, другой важный активатор тромбоцитов, также реализует свое действие с.участием фосфолипазы А2 (рис.12).

Тромбоксан А₂ (Ткс А₂) — мощнейший агрегирующий агент, иг­рающий чрезвычайную роль в агрегации тромбоцитов. Ткс А₂ секретируется тромбоцитом и при связывании с рецептором на тромбоцитарной мембране обеспечивает почти немедленное высвобождение содержимого гранул тромбоцитов по фосфатидилинозитольному механизму, а также увеличение концентрации Са²^ в цитоплазме, что сопровождается активацией тромбоцита.

Индукторами агрегации тромбоцитов являются также АДФ, серотонин. адреналин, простагландины G₂ и Н₂. фактор агрегации тромбоцитов и ряд других веществ, имеющие специфические рецепторы на плазматической мембране тромбоцитов. При действии индукторов агрегации тромбоцитов в итоге из плотных гранул тромбоцитов мобилизуется Са. Активированный тромбоцит из дисковидной формы с гладкой поверхно­стью превращается в сферически-шиповидную: набухает, округляется и выде­ляет отростки. Это увеличивает контактную поверхность тромбоцита и способ­ность тромбоцитарных мембран к деформации и взаимодействию с другими клетками.

3. Агрегация тромбоцитов. Несмотря на то, что индукторами агрегации тромбоцитов являются различные по своей структуре и функции вещества, механизм агрегации универсален и заложен в самих тромбоцитах. Начальная агрегация тромбоцитов инициируется микроколичествами АДФ, выделяющегося при повредждении эндотелиальных клеток и эритроцитов. Активированные тромбоциты очень быстро покидают кровоток. Соединяясь в агрегаты по 5-10-20 клеток, они оседают на уже адгезированных тромбоцитах. В результате адгезии и начальной агрегации тромбоцитов осуществляется "реакция освобож­дения" первого порядка и из плотных гранул тромбоцитов в кровоток секретируются АДФ, серотонин и адреналин, активирующие циркулирующие тромбо­циты. В результате этого гемостатическая пробка быстро увеличивается в объ­еме и уже через 1-3 мин полностью восполняет дефект кровоточащего сосуда.

Процесс агрегации тромбоцитов, индуцируемый АДФ, носит двухфаз­ный характер. Первая фаза-, продолжительностью до двух минут, — обратимая. В первой фазе агрегаты рыхлые, непрочные, легко разрушаются и недос­таточно хорошо фиксируются. Если на этом этапе активация тромбоцитов пре­кращается, то тромбоцитарные агрегаты могут дезагрегировать, так как сокра­тившиеся тромбоциты способны и к расслаблению.

Механизм дезагрегации тромбоцитов. Для релаксации тромбоцитов и их воз­вращения к неадгезирующей дисковидной форме необходима реинтеграция ионов кальция, в последующем вновь скапливающихся в системе плотных тру­бочек цитоплазмы. Связывание кальция в цитоплазме тромбоцита осуществляется специфическим протеином, содержащим фосфатные группировки. Цикли­ческий аденозинмонофосфат (ц АМФ) индуцирует фосфорилирование этого белка и. соответственно, увеличение уровня цАМФ в цитоплазме приводит к уменьшению ионов кальция и расслаблению тромбоцита. Последний вновь приобретает свою дисковидную форму, его мембрана — свою напряженность, и одновременно теряется ее аффинность к другим мембранам. Таким образом, релаксация тромбоцитов является следствием увеличения содержания цАМФ в цитоплазме.

Как и во всех клетках, содержание цАМФ в тромбоцитах зависит от двухферментов: аденилатциклазы (переводит АТФ в цАМФ) и сфосфодиэстеразы (переводит цАМФ в линейный 5'-АМФ).

Физиологическим стимулятором тромбоцитарной аденилатциклазы явля­ется простациклин, как и ПГ Е₂, ПГ Д:, ПГ H₂) хотя и в меньшей степени. Простациклин (ПГ I₂) - это продукт превращения арахидоновой кислоты в эндотелиальных клетках. Простациклин постоянно синтезируется в эндотелии со­судов в малых количествах и, следовательно, здоровая стенка сосуда активно препятствует формированию тромбоцитарного агрегата на своей поверхности. К тому же, тромбоцитарный агрегат на сосудистой стенке является источником эндопероксидов, которые могут быстро превращаться в простациклин в эндотелии сосудов (рис.14). Соотношение количества простациклина в эндотелиальных клетках и активности тромбоцитов в процессе тромбообразования име­ет большой физиологический смысл: тромбоцитарный тромб, формируясь в месте повреждения сосуда, не должен распространяться по неповрежденной сосудистой стенке, а местная активация тромбоцитов не должна становиться распространенной (диссеминированной). Стимулированные эндотелиальные клетки у края повреждения, синтезируя простациклин, вынуждают тромбоциты вернуться к своей первоначальной дисковидной форме, тем самым останавли­вая избыточную активацию тромбоцитов. Простациклин является наиболее мощным физиологическим антиагрегантом. Аспирин (ацетилсалициловая кислота) оказывает противотромботическое действие, необратимо ингибируя циклоксигеназную систему синтеза Ткс А_2. Аспирин также ингибирует циклоксигеназу эндотелия сосудов, участвующую в синтезе простациклина (рис. 14) . Эндотелиальные клетки, в отличие от тромбоцитов, регенерируют циклоксиге-назу в течение нескольких часов, поэтому баланс между Ткс А₂ и простациклином изменяется в пользу последнего, препятствуя агрегации тромбоцитов. Аналогично действуют и такие нестероидные противовоспалительные препа­раты, как индометацин и фенилбутазон.

Ингибирование фосфодиэстеразы препятствует нормальному катаболиз­му цАМФ, приводя к увеличению его концентрации в цитоплазме. Ингибиторы фосфодиэстеразы (дипиридамол, теофиллин) используются как притивотромботические средства.

Мощным ингибитором агрегации тромбоцитов является также оксид азота (NO) Оксид азота активирует гуанилатциклазу, что сопровождается синтезом цГМФ, который приводит к уменьшению концентрации Са²* в цито­плазме тромбоцитов. Таким образом, N0 является синергистом простациклина.

Таков механизм дезагрегации тромбоцитов, от скорости которой также во многом зависит наклоность человека к кровоточивости и тромбообразованию.

Необратимая агрегация тромбоцитов. Если стимуляция тромбоцитов достаточ­на по интенсивности и продолжительности, агрегация из первой, обратимой, фазы переходит в фазу необратимой агрегации. Агрегация тромбоцитов про­исходит быстро и необратимо под действием больших доз АДФ и/ или Ткс А₂, либо при комплексном влиянии нескольких агрегирующих агентов (например, коллаген+АДФ+адреналин), либо при дополнительном воздействии малых доз тромбина.

Синтез тромбина запускается тканевым тромбопластином, выделяющимся из поврежденных тканей и эндотелия. Образующееся на первых этапах мини­мальное количеств тромбина, недостаточное для гемокоагуляции, запускает важные реакции первичного гемостаза. Под действием тромбина в тромбоци­тах идет "реакция освобождения" второго порядка и в кровоток секретируются Ткс А₂ и АДФ в высоких концентрациях, а также фактор Виллебранда, фибронектин, фибриноген, тромбоспондин, фактор V, серотонин, адреналин, ПГ G₂ и Н₂. Из эндотелиоцитов высвобождается также фактор агрегации тромбоцитов. Такие ицщества, как тромбоксан А₂, простагландипы G₂ и Н₂, серотонин, адре­налин, фактор агрегации тромбоцитов, связываясь на поверхности тромбоцитов, повышают концентрацию Са²⁺ в цитоплазме, что сопровождается и экспрессией рецепторов IIЬ/IIIа на поверхности тромбоцитов, стимулируя таким образом агрегацию и адгезию тромбоцитов.

Действие этих веществ не ограничивается теми тромбоцитами, где про­исходит их синтез. Агрегированные тромбоциты секретируют эти вещества и в направлении циркулирующих тромбоцитов, что активирует дополнительные тромбоциты. Таким образом, активация клеточного (тромбоцитарного) гемостаза имеет цепной характер. Высвобождаемые из тромбоцитов белки —.фак­тор Виллебранда, фибриноген, тромбоспондин — связываются в комплекс с мембранными рецепторами-интегринами (ГП IIЬ/IIIа) на поверхности тромбоцитов, связывая при этом соседние (рядом расположенные) тромбоциты и об­разуя Стабильный тромбоцитарный агрегат. Тромбоспондин связывает тромбо­циты с фибрином, коллагеном, эндотелиоцитами, моноцитами, макрофагами и агрегация приобретает необратимый характер. Фибронектин связывается не только с рецепторами форменных элементов крови и эндотелиальных клеток, но и с фибрином, что способствует упрочнению тромба.

Ингибиторами агрегации тромбоцитов служат парапротеины и продукты деградации фибрина, а также простациклин-зависимый белок (фактор Бернес-Лиана).

Важную роль в консолидации тромбоцитарного тромба, а также в рет­ракции кровяного сгустка играет сходный с актомиозином сократительный бе­лок кровяных пластинок — тромбостенин, локализующийся в микротрубочках и микрофибриллах этих клеток. При сокращении тромбостенина происходит сближение тромбоцитов в агрегате, который становится плотным и непрони­цаемым для крови.

Тромбоциты, как и другие клетки крови, участвуют не только в образова­нии первичного клеточного тромба, но и в активации гемокоагуляции. Они создают поверхность, на которой происходит взаимодействие и активирование факторов свертывания крови, а также защищают их от разрушения ингибиторами, содержащимися в плазме. Кроме этого, они выделяют факторы, активи­рующие процесс тромбообразования (см. стр. 8) .

Уменьшение количества тромбоцитов (тромбоцитопения) или их функ­циональная неполноценность (тромбоцитопатия) ведут к нарушению тромбоцитарно-сосудистого гемостаза, что проявляется кровоточивостью.