2. Использование методов биотехнологии при получении лекарственных веществ
Биотехнология — одно из важнейших направлений получения лекарственных средств из микроорганизмов, тканей животных и растений. В результате разрабатываются комплексные препараты. Начинается конкуренция между традиционными синтетическими лекарственными средствами и биофармацевтическими препаратами. Становится привычным новый термин «биофармация».
Действующее вещество биотехнологических препаратов имеет биологическое происхождение и является производным от живых клеток, обладает сложной гетерогенной молекулярной структурой.
Исходным субстратом служат клетки животного происхождения или микроорганизмы (бактерии типа E.coli, дрожжи и пр.), используются их клеточные и субклеточные структуры.
Существенным отличием биотехнологических лекарственных средств является то, что в них используется естественная способность к метаболизму. Для их получения производится изоляция и изменение геномной ДНК исходного продукта таким образом, что он получает новую, неспецифическую для данного вида способность к биосинтезу, которая и используется в лекарственных средствах. В первую очередь здесь следует назвать создание генно-модифицированных организмов для получения рекомбинантных терапевтических протеинов.
2.1 Генная инженерия и лекарственные препараты
Генетическая инженерия (генная инженерия) — устанавливает методы и приемы, а также технологии получения рекомбинантных ДНК и РНК, выделения генов из организма (клеток).
Перспективным направлением является развитие генных технологий.
1. Они способны существенно оптимизировать традиционную фармакотерапию (фармакогеномика).
2. Особые надежды возлагаются на генно-инженерные разработки препаратов для защиты от инфекционных болезней и патогенов.
Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.
До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического действия иногда был недостаточно изучен. С помощью новой технологии получают весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты применяют для лечения различных заболеваний человека. Как обычно, сначала их проверяют на животных, а потом проводят тщательные клинические испытания.
2.2. Лекарственные препараты на основе генно-инженерных моноклональных антител
Одним из основных достижений биотехнологии в области медицины является создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов с использованием методов генной инженерии. Это в полной мере касается лекарственных средств, разработанных на основе генно-инженерных моноклональных антител (МкАТ). Создание лекарственных препаратов на основе антител (АТ), специфичных к определенным антигенам (АГ), является перспективным, поскольку иммунная защита организма во многом обусловлена его способностью синтезировать АТ в ответ на чужеродные АГ и удалять их из организма. Обычно Th2-зависимый иммунный ответ, при котором основным действующим началом, определяющим специфичность механизмов защиты, являются гуморальные АТ, развивается на микроорганизмы или их токсины при их внеклеточной локализации. При лечении патологии, вызываемой подобными инфекционными агентами, успешно используют препараты иммуноглобулинов, обогащенных специфическими АТ.
Препараты иммуноглобулинов человека не являются чужеродными для человеческого организма. Их получают из смеси сывороток крови здоровых доноров (не менее чем от 5000 доноров), используя в производстве усовершенствованные технологии – частичное расщепление протеолитическими ферментами, восстановление и алкилирование, обработку сольвентдетергентами, хроматографическую очистку, фильтрацию, ультрафильтрацию и т.д.
Использование современных высокоэффективных методов выделения и очистки позволяет снизить возможность развития побочных реакций на препараты иммуноглобулинов.
Однако получение широкого спектра специфических АТ в препаратах иммуноглобулинов человека, а также получение достаточного количества АТ необходимой специфичности значительно ограничены, кроме того, не исключена возможность контаминации препаратов инфекционными агентами.
Разработка технологии получения МкАТ с использованием методов генной инженерии дает возможность реализации терапевтического потенциала лекарственных препаратов на основе АТ.
Препараты МкАТ, характеризующиеся высокой специфичностью, стандартностью и технологичностью получения, при определенных клинических показаниях часто способны успешно заменить иммунные сыворотки и препараты иммуноглобулинов.
Источником получения МкАТ являются клонированные клетки или организм животного. АТ могут быть получены путем использования иммортализованных («бессмертных») В-лимфоцитов в перевиваемой культуре клеток, либо путем использования клеточных линий, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК.
МкАТ характеризуются постоянством физико-химических свойств, высокой специфичностью, направленностью к строго определенной детерминанте АГ, секретируются одним клоном антителообразующих клеток или клетками гибридом.
Получение рекомбинантных препаратов значительно дешевле, чем получение препаратов из другого биологического сырья, они оказывают меньше побочных эффектов, их специфическая фармацевтическая активность выше, однако возможно формирование АТ против рекомбинантных иммуноглобулинов, имеющих антигенные характеристики мышиных АТ (HAMA-ответ, Human Anti-Mouse Antibody).
Для снижения чужеродности МкАТ используют молекулярно-генетическую технологию, которая позволяет приблизить структуру МкАТ к структуре иммуноглобулина человека. С помощью данной технологии создают генетические комплексы, в которых ген, кодирующий вариабельный домен иммуноглобулина мышиных МкАТ (V-ген), объединен с геном, кодирующим константный домен иммуноглобулина человека нужного изотипа (С-ген). При этом специфичность АТ определяется генами мыши, а их антигенная характеристика, в значительной степени, – генами человека. На основе данной технологии разработаны химерные и гуманизированные МкАТ.
В химерных МкАТ вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека замещены соответствующими доменами иммуноглобулина мыши или крысы, которые и определяют требуемую антигенную специфичность АТ.
В гуманизированных МкАТ участки, определяющие комплементарное связывание антигена (CDRs), т.е. три короткие гипервариабельные последовательности вариабельных доменов каждой цепи иммуноглобулина имеют мышиное (или другое) происхождение, они встроены в вариабельный домен иммуноглобулина человека. Гуманизированные МкАТ содержат минимум последовательностей грызунов.
В настоящее время лекарственные препараты МкАТ по объему производства занимают на мировом фармацевтическом рынке второе место после вакцин. 80% препаратов МкАТ используется в онкологии. Для лечения онкологических заболеваний используют два типа МкАТ – простые, неконъюгированные АТ (рис. 3.1), т.е. не связанные с цитотоксическими веществами и конъюгированные (рис. 3.2) – АТ, связанные с радиоактивными частицами, цитостатиками или токсинами (иммунотоксинами).
АТ обеспечивают адресную доставку токсичного препарата к опухолевым клеткам, чем и обусловлен терапевтический эффект указанных АТ.
Рис. 3.1. Взаимодействие неконъюгированных МкАТ с клеткой-мишенью
Рис. 3.2. Схема взаимодействия конъюгированных МкАТ с опухолевой клеткой
2.3.ДНК-технология в усовершенствование производства антибиотиков
К антибиотикам относятся низкомолекулярные вещества, различающиеся по химической структуре. Общее для этих соединений то, что, являясь продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, они в ничтожных концентрациях специфически нарушают рост других микроорганизмов.
Большинство антибиотиков относится к вторичным метаболитам. Их, как и токсины и алкалоиды, нельзя отнести к строго необходимым для обеспечения роста и развития микроорганизмов веществам. По этому признаку вторичные метаболиты отличаются от первичных, в присутствии которых наступает гибель микроорганизма.
Большая часть актиномицетов, синтезирующих антибиотические вещества, включая тетрациклины, относится к роду Streptomyces.
Новая биотехнология, основанная на использовании штаммов-супер продуцентов антибиотиков, предполагает совершенствование механизмов защиты продуцента от синтезируемого им антибиотика.
С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomycesspp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется, и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не исключают друг друга.
Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscillasp. синтезирует гомодимерныйгемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S.coelicoior даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки S.coelicoior, растущие при низком содержании растворенного кислорода (примерно 5% от насыщающей концентрации), синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетранс формированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода.
Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из десятков ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза — задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержащего функциональный экс премирующийся ген антибиотика (т.е. ген, восстанавливающий утраченную мутантным штаммом функцию), и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь, по крайней мере, по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров.
С помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из Penicilliumchrysogenum гена синтетазыизопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию 5-(1_-а-аминоадипилН— цистеинил-Р-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов.
Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генно-инженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе которого был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика.