6. Подсчет и анализ лейкоцитарной формулы.

Определение лейкоцитарной формулы

Ц ель: Подсчитать лейкоцитарную формулу (процентное соотношение различных видов лейкоцитов) в окрашенных мазках крови.

Приготовление мазков: На сухое обезжиренное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят небольшую каплю крови стеклянной палочкой или непосредственно из места укола пальца и оставляют стекло в горизонтальном положении. Шлифовальное стекло, которым будет сделан мазок, ставят на предметное под углом 30 – 45° на 1 – 2 мм перед каплей крови и движут назад так, чтобы оно коснулось крови и капля распространилась по всему короткому ребру шлифовального стекла. Затем быстрым движением вперед вдоль стекла делают мазок.

Мазки высушивают на воздухе и маркируют. Высохший мазок должен быть равномерно тонким слоем, желтоватого цвета, занимать около ¾ общей длины стекла и заканчиваться «метелочкой».

Фиксация. Фиксация мазков необходима, чтобы впоследствии клетки не претерпели каких-либо морфологических изменений и чтобы предотвратить повреждение мазка при дальнейшем окрашивании.

Фиксируют мазки в метаноле (или в 75 %-м этаноле) в течение 5 минут, а затем высушивают на воздухе. Фиксированные мазки окрашивают любым классическим способом (по Романовскому – Гимзе, Май – Грюнвальду и т.д.).

Окраска по Романовскому – Гимзе. Краситель Романовского – Гимзы состоит из щелочной и кислой частей. Щелочная часть – азур II, а кислая часть – эозин. Азур II окрашивает в ярко-синий цвет, эозин – в розово-красный.

Приготовление растворов. Чтобы приготовить основной раствор красителя, растворяют 30 г азура II – эозина и 0,8 г азура II (или 3,8 г сухой красящей смеси Гимзы) в 250 мл глицерина, нагревая при этом 90 – 120 мин при 560 С, а затем прибавляют 250 мл метилового спирта. В настоящее время чаще всего используют готовый краситель Романовского-Гимзы, из которого перед началом работы готовят раствор из расчета: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Ход окраски: высохший фиксированный мазок помещают в кювету с рабочим раствором краски на 25 – 40 минут (время окраски устанавливают опытным путем для каждой новой партии красителя).

Результат окраски: Ядра клеток – красно-фиолетовые. Эозинофильные гранулы красновато – коричневые, базофильные – синие, нейтрофильные – фиолетовые. Цитоплазма лимфоцитов голубая, иногда с нежными азурными гранулами красного цвета. Эритроциты бледно – красноватого цвета. Тромбоциты имеют более светлую, синюю наружную часть и фиолетовую внутреннюю.

Дифференциальный подсчет лейкоцитарной формулы.

Реактивы: Иммерсионное масло, Диэтиловый эфир.

Специальное оборудование: Микроскоп, 11-клавишный счетчик для подсчета лейкоцитарной формулы.

Ход исследования: с помощью объектива 10 Х (малого увеличения) находят край мазка крови. Наносят каплю иммерсионного масла и, не меняя положения стекла, переводят иммерсионный объектив (90 Х) таким образом, чтобы он погрузился в каплю масла. Подбирают с помощью микровинта соответствующее фокусное расстояние, устанавливая четкую видимость клеток. Приступают к дифференцированию лейкоцитов, отмечают клетки с помощью 11 – клавишного счетчика; необходимо просчитать не менее 200 лейкоцитов. Подсчет лейкоцитов проводят, соблюдая следующее правило: отступив 2 – 3 поля зрения от края мазка, затем 3 – 5 полей зрения вдоль края мазка, затем 3 – 5 полей зрения под прямым углом по направлению к середине мазка, снова 3 – 5 полей зрения параллельно краю, затем под прямым углом по направлению к краю и т.д.; таким образом, стекло двигают по зигзагу (линия «меандра»). Просчитав около половины клеток на одном краю мазка, меняют положение стекла и другую половину клеток считают на противоположном крае.

При исследовании лейкоцитарной формулы необходимо дифференцировать неразрушенные лейкоциты.

Нейтрофилы имеют бледно-розовую цитоплазму с нейтрофильными гранулами, окрашивающимися в розово-фиолетовый цвет. Форма ядра нейтрофилов зависит от их зрелости. Палочкоядерные нейтрофилы, являющиеся более молодыми клетками, имеют ядро в виде изогнутой палочки. У зрелых нейтрофилов ядро вследствие перекручивания разделено на ряд сегментов, связанных очень тонкими, иногда почти незаметными нитями. Это полиморфноядерные, или сегментоядерные, нейтрофилы.

У эозинофилов и базофилов цитоплазма окрашена очень слабо. Эозинофилы имеют ярко окрашенные красные гранулы, окрашивающиеся эозином. Ядро эозинофилов по структуре близко к ядру нейтрофилов: более молодые клетки имеют палочковидное ядро, более зрелые – сегментированное. Однако сегментация ядра выражена меньше. Ввиду относительной малочисленности эозинофилов учет палочкоядерных и сегментоядерных форм в отдельности не производится. Базофилы в цитоплазме содержат крупные темные фиолетовые или ультрамариновые гранулы, часто закрывающие отдельные участки ядра. Ядро базофилов неправильной формы, окрашивается в фиолетово-розовый цвет.

Лимфоциты и моноциты, составляющие группу агранулоцитов, не содержат зернистости в цитоплазме. Клетки лимфоцитов округлые, с круглым или овальным ядром, которое окружено или очень узким (малые лимфоциты), или более широким (средние и большие лимфоциты) пояском цитоплазмы. Цитоплазма лимфоцитов голубая. Часто она видна лишь с одной стороны от ядра (в виде серпа). В некоторых клетках и этот серп незаметен, и тогда малый лимфоцит имеет вид «голого ядра». Моноциты крупнее лимфоцитов, большей частью круглой, иногда неправильной формы, с хорошо выраженной цитоплазмой. Цитоплазма моноцитов серо-голубая. Ядро сравнительно велико и имеет выступы и углубления. Обычно оно «бобовидной» формы. Интенсивность окраски ядра моноцитов слабее, чем лимфоцитов.