4. Работа с микроскопами изучение мазков крови человека и лягушки

1. Составные компоненты крови: форменные элементы (эритроциты, тромбоциты, лейкоциты) и плазма крови.

2. Морфофункциональная характеристика эритроцитов:

1. Размеры: нормоциты – 7,0 – 7,9 мкм; макроциты – больше 8,0 мкм; микроциты – меньше 6,0 мкм.

2. Форма: двояковогнутые диски - дискоциты (80 %); остальные 20 % составляют сфероциты, планоциты, эхиноциты, седловидные, двуямочные, стоматоциты.

3. Ядро: не содержат.

4. Цитоплазма: заполнена пигментным включением – гемоглобином, нет большинства органелл.

5. Функции: дыхательная - транспорт газов (О2 и СО2); транспорт других веществ, абсорбированных на поверхности цитолеммы (гормонов, иммуноглобулинов, лекарственных веществ, токсинов и других).

6. Изменение количества в крови: у человека в 1 мм³ крови 4,5—5 млн

7. Продолжительность жизни: около 120 дней.

8. Место гибели: преимущественно селезенка.

3. Лейкоформула здорового взрослого человека - это процентное соотношение различных форм лейкоцитов (к общему числу лейкоцитов - 100 %). В таблице классификации лейкоцитов представлена лейкоцитарная формула здорового организма.

4. Морфофункциональная характеристика гранулоцитов

1. Типы клеток: нейтрофилы: юные; палочкоядерные; сегментоядерные; эозинофилы; базофилы.

2. Размеры: колеблется в приделах 9-13 мкм

3. Форма:

Нейтрофилы: в цитоплазме имеются мелкие гранулы, окрашивающиеся в слабо оксифильный (розовый) цвет, среди которых различают неспецифические азурофильные гранулы - разновидность лизосом, специфические гранулы, другие органеллы развиты слабо.

Эозинофилы: в цитоплазме крупная оксифильная (красная) зернистость, состоящая из двух типов гранул: специфические азурофильные - разновидность лизосом, содержащих фермент пероксидазу, неспецифические гранулы, содержащие кислую фосфатазу, другие органеллы развиты слабо.

Базофилы: в цитоплазме содержатся крупные гранулы, окрашивающиеся основными красителями, метахроматично, за счет содержания в них гликозоаминогликанов - гепарина, а также гистамина, серотонина и других биологически активных веществ; другие органеллы развиты слабо.

4. Ядро:

Нейтрофилы: сегментированное ядро;

Эозинофилы: двухсегментное ядро;

Базофилы: крупное слабо сегментированное ядро;

5. Функции:

Нейтрофилы: фагоцитоз бактерий; фагоцитоз иммунных комплексов (антиген-антитело); бактериостатическая и бактериолитическая; выделение кейлонов и регуляция размножения лейкоцитов.

Эозинофилы: участвуют в иммунологических (аллергических и анафилактических) реакциях; угнетают (ингибируют) аллергические реакции посредством нейтрализации гистамина и серотонина.

Функции базофилов заключаются в участии в иммунных (аллергических) реакциях посредством выделения гранул (дегрануляции)и содержащихся в них вышеперечисленных биологически активных веществ, которые и вызывают аллергические проявления (отек ткани, кровенаполнение, зуд, спазм гладкой мышечной ткани и другие).

6. Продолжительность жизни: от нескольких часов до нескольких месяцев, предположительно 8 дней.

5. Морфофункциональная характеристика агранулоциов

1. Типы клеток: лимфоциты и моноциты.

2. Размеры: малые 4,5-6 мкм; средние 7-10 мкм; большие - больше 10 мкм.

3. Форма: Моноциты: часто содержит в большом количестве мелкую азурофильную зернистость. Нередко в цитоплазме содержатся вакуоли, расположенные возле ядра, фагоцитированные клетки, пигментные зерна и др. Лимфоциты: узкий ободок базофильной цитоплазмы, в которой содержатся свободные рибосомы и слабо выраженные органеллы - эндоплазматическая сеть, единичные митохондрии и лизосомы.

4. Ядро: Моноциты: ядро занимает большую или равную с цитоплазмой часть клетки. Лимфоциты: относительно крупное круглое ядро, состоящее в основном из гетерохроматина.

5. Функции: В-лимфоциты и плазмоциты обеспечивают гуморальный иммунитет - защиту организма от чужеродных корпускулярных антигенов (бактерий, вирусов, токсинов, белков и других); Т-лимфоциты по выполняемым функциям подразделяются на: - киллеров; - хелперов; - супрессоров. Киллеры или цитотоксические лимфоциты обеспечивают защиту организма от чужеродных клеток или генетически измененных собственных клеток, осуществляется клеточный иммунитет. Т-хелперы и Т-супрессоры регулируют гуморальный иммунитет: хелперы - усиливают, супрессоры - угнетают.

6. П родолжительность жизни: от многих лет (В-клетки памяти) до нескольких недель (клоны плазматических клеток).

Рис. 3 Лейкоформула взрослого человека.

Препарат. Мазок крови человека:

Окраска по Романовскому-Гимзе. (Краситель Романовского – Гимзы состоит из щелочной и кислой частей. Щелочная часть – азур II, а кислая часть – эозин. Азур II окрашивает в ярко-синий цвет, эозин – в розово-красный). На препарате необходимо найти и зарисовать эритроциты, окрашенные эозином в розовый цвет. Так как эритроциты имеют форму двояковогнутого диска, центральная часть их более тонкая и имеет более светлую окраску. Эритроциты самые многочисленные клетки крови, и на мазке они составляют большинство. Среди эритроцитов видны лейкоциты (1 – 5 в поле зрения).

Наиболее часто встречаются сегментоядерные нейтрофилы, имеющие темно-фиолетовое сегментированное ядро и почти прозрачную (слабо-розовую) цитоплазму с очень мелкой, трудно различимой зернистостью. Эозинофильные гранулоциты, наоборот, отличаются ярко выраженной оксифилией цитоплазмы, заполненной крупными розовыми гранулами одинаковых размеров. Ядро менее плотное, чем у сегментоядерного нейтрофила, обычно имеет два сегмента, но может быть и три. Базофильные гранулоциты встречаются редко, поэтому их следует посмотреть и зарисовать с демонстрационного препарата. Для них характерны бледные, не всегда полностью сегментированные ядра и фиолетовые разных размеров (преимущественно крупные) гранулы в цитоплазме.

Лимфоциты в отличие от гранулоцитов имеют округлое ядро и малый ободок цитоплазмы. Хроматин ядра резко конденсирован, поэтому на препаратах имеет темно-фиолетовую окраску. Малые, средние и большие лимфоциты отличаются друг от друга по размерам и плотности ядер. Малые лимфоциты имеют очень конденсированный хроматин в ядре и узкий ободок цитоплазмы. Хроматин ядра среднего лимфоцита несколько более дисперсный, а ободок цитоплазмы шире. Ядро большого лимфоцита еще более крупное и рыхлое, а объем цитоплазмы увеличен.

Моноциты легче найти на периферии мазка. Это крупные клетки, имеющие обширную зону цитоплазмы голубого цвета и крупное бобовидное или неправиьной формы бледно окрашенное ядро.

Кровяные пластинки имеют небольшие размеры (в три раза меньше эритроцита), расположены небольшими группами между клетками и имеют слабо-фиолетовую окраску.

Мазок крови лягушки:

Кровь других позвоночных по своему составу сходна с кровью человека, но в морфологии клеточных элементов у различных групп животных имеются свои особенности.

На препарате при большом увеличении видно, что среди форменных элементов крови преобладают красные кровяные клетки – эритроциты. В отличие от эритроцитов человека они представляют собой крупные овальные двояковыпуклые клетки с гомогенной протоплазмой. Центр клетки занимает ядро, имеющее овальную форму, интенсивно окрашивающееся гематоксилином в сине-фиолетовый цвет. Цитоплазма этих клеток окрашивается эозином в оранжево-красноватый цвет за счет гемоглобина, растворенного в теле этой клетки. В 1 мм3 крови содержится около 380 тыс. эритроцитов. Лейкоцитов содержится значительно меньше (в 1 мм 3 крови – от 6 до 25 тыс.): гранулоциты и агранулоциты. В количественном отношении у человека преобладают зернистые, у амфибий незернистые, а именно лимфоциты – округлые клетки, более мелкие, чем эозинофилы и эритроциты, с плотным округлым ядром и узкой каймой голубой (базофильной) цитоплазмы. Часто эти клетки имеют короткие, неправильной формы псевдоподии.

Лейкоциты по своей структуре очень похожи на таковые человека. Среди гранулоцитов встречаются нейтрофилы, эозинофилы (округлые клетки, по величине превышающие эритроциты, с 3 – 4 сегментным плотным ядром и ярко-оранжевой зернистостью в цитоплазме), базофилы. Среди агранулоцитов – лимфоциты и моноциты.

На препарате встречаются тромбоциты – клетки, расположенные группами от 3 до 6. Тромбоциты значительно меньше эритроцитов; в отличие от эритроцитов их протоплазма почти не окрашивается. Тромбоциты амфибий являются настоящими клетками, обладающими ядром. Форма клетки и ядра – овальная.

5. Забор крови из пальца. Исследование реологических параметров крови. Изучение деформабильности эритроцитов; агрегации эритроцитов с помощью Агрегометра MA-1, фирмы «Myrenne». Ознакомление с принципом работы биохемилюминометра БХЛ-3606М. Биохемилюминесцентный анализ цельной крови человека. Спектрофлуориметрический анализ

Реологические параметры крови:

Составляя примерно половину объема всей крови, форменные элементы крови - клетки обеспечивают важнейшие ее функции. Эритроциты - наиболее многочисленная фракция клеток, их количество в 1 мкл крови около 5 млн. В крови низших позвоночных эритроциты обладают всем комплексом внутриклеточных органоидов, в том числе ядром, и делятся путем митоза или амитоза. У млекопитающих во время созревания эритроциты теряют внутриклеточные органоиды и ядро, при этом они приобретают двояковогнутую форму и утрачивают способность к делению. Средний диаметр эритроцитов взрослого человека около 7 мкм, новорожденного до 10 мкм. Форма эритроцитов изменяется благодаря эластичности их мембраны, что позволяет им проходить через капилляры, большинство которых имеют диаметр 5 мкм. Известны примерно пять нормальных форм эритроцитов и до 10 патологических. Поддержание формы клеток обеспечивается за счет энергии содержащейся в них АТФ, которая образуется в процессе гликолиза, поэтому эритроциты активно потребляют глюкозу.

По сравнению с мембранами других клеток, мембраны эритроцитов изучены наиболее полно. Белки занимают около 1/4 поверхности мембраны, "плавая" на двойном слое липидов и частично или полностью его пронизывая. Общая площадь мембраны одного эритроцита достигает 140 мкм2, ее масса 10-12 г. Липиды (холестерин, нейтральные липиды, лецитин) составляют около 40% сухого остатка мембраны, 10% приходится на углеводы. Один из белков мембраны - спектрин располагается на ее внутренней стороне, непосредственно над цитоплазмой, образуя упругую выстилку, благодаря которой эритроцит не разрушается, изменяя форму при движении в узких капиллярах и при колебаниях рН, температуры, осмотических показателей. В одном эритроците насчитывается около 200 000 молекул спектрина. Другой белок - гликофорин, представляющий собой гликопротеид, пронизывает липидные слои мембраны и выступает наружу. К его полипептидным цепям присоединены группы моносахаридов, связанные, в свою очередь, с молекулами сиаловой кислоты. Общее число молекул этого белка до 500 000 в одном эритроците.

Часть транспортируемых кровью веществ растворена в плазме, а другая часть соединяется с белками и клетками крови. Билирубин (вещество желтого цвета, образующееся в результате разрушения гемоглобина при старении эритроцитов) соединяется с альбуминами плазмы в соотношении 5:1 и транспортируется к органам выделения: почкам, печени, кишечнику. Липопротеиды плазмы транспортируют холестерин - один из распространенных фосфолипидов, входящих в состав мембран. Избыточное отложение этого вещества в стенках кровеносных сосудов связывают с развитием атеросклероза.

Белки плазмы переносят также ионы, токсичные в свободном состоянии (железо, медь), к органам, где они используются в процессах биосинтеза. Благодаря транспорту создается временное депонирование некоторых веществ. Так, эритроциты транспортируют инсулин, который в связанном состоянии неактивен, а также альбумин, глюкозу, аминокислоты. Один эритроцит способен присоединить до 109 молекул альбумина. Альбумин в свою очередь, является переносчиком продуктов метаболизма при онкологических заболеваниях. И повышение его концентрации в крови четко указывает на существующую патологию, связанную с раковой опухолью.

Для исследования способности эритроцитов к деформации используют различные экспериментальные методы:

1. Метод аспирации эритроцитов в микропипетку, имеющую внутренний диаметр 2,8-3 мкм;

2. Метод центрифугирования - о способности эритроцитов к деформации судят по изменению их размеров под действием центробежных сил;

3. Метод фильтрации - определяют скорость прохождения эритроцитов через бумажные, нитроцеллюлозные или поликарбонатные фильтры, имеющие фиксированные размеры пор ( 3 мкм);

4. Реоскопия - измеряют под микроскопом размеры эритроцитов, деформируемых потоком жидкости;

5. Эктацитометрия - в основе этого метода лежит явление дифракции лучей гелий-неонового лазера на тонком слое эритроцитов, деформируемых потоком вязкой жидкости, что приводит к изменению дифракционной картины, по которой судят о деформабильности эритроцитов

При активации эритроцитов и тромбоцитов возникает однотипная реакция, завершающаяся активацией фосфолипазы. В результате мембрана клетки становится податливой и может вступать в контакт с соседними клетками. Вследствие этого тромбоциты могут агрегировать друг с другом и образовывать тромбоцитарный тромб. Активирование тромбоцитов - очень важный этап гемостатического процесса, ибо он лежит в основе как нормального гемостаза, так и патологического образования тромбов и диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Постоянное избыточное активирование тромбоцитов - один из существенных этапов атерогенеза и сосудистых поражении. Вместе с тем из-за нарушения активации эритроцитов, замедления или прекращения адгезии и агрегации, усиления дезагрегации возникают тяжелые геморрагии. Активация тромбоцитов главным образом связывается с приобретением пластинками способности к полноценным адгезии и агрегации. Агрегация тромбоцитов может быть обратимой и необратимой. Агрегация обратимая непосредственно трансформируется в агрегацию необратимую.

Рис. 4 Устройство для определения деформабильности эритроцитов

Агрегация быстрая необратимая, когда на тромбоциты действуют тромбин, а также коллаген и АДФ в высоких концентрациях. Последние тоже увеличивают выведение Са2+ в цитоплазму. В настоящее время распространенные способы оценки агрегации эритроцитов заключаются в исследовании скорости и степени уменьшения оптической плотности (увеличения светопропускающей способности) тромбоцитарной плазмы при перемешивании с индукторами агрегации (при изучении спонтанной агрегации они не добавляются). Образование агрегатов тромбоцитов под действием стимуляторов может быть оценено также визуально, или с помощью микроскопа. Наиболее существенными для кровообращения являются показатели, характеризующие гидродинамическую прочность, скорость образования и размер агрегатов.

Прочность агрегатов, т.е. способность разрушаться при высоких скоростях сдвига, определяет их судьбу в артериальной системе, а значит и судьбу микроциркуляции. Нормальная (физиологическая) агрегация имеет характер линейных цепочек в виде монетных столбиков, состоящих из 5-6 клеток и возможной полной гидродинамической дезагрегации эритроцитов в сосудистом русле

Сетчатая и глыбчатая агрегация с увеличением прочности сцепления между эритроцитами есть главный признак патологической агрегации. Глыбчатая агрегация превращает кровь из эмульсии в грубую суспензию, т.к. агрегация, сохраняющаяся при высоких скоростях сдвига. Факторы, показывающие суспензионную стабильность крови и определяющие увеличение когезии между клетками, могут быть эритроцитарные, т.е. связанные с изменением формы или модификации поверхности мембраны эритроцитов, и плазменные-изменение белкового состава плазмы.

Лабораторная работа №1

Цель: изучение агрегометрических параметров крови человека.

Приборы и оборудование: скарификаторы стерильные, спиртовые шарики, вата, пробирки, микропипетки, капилляры, агрегометр MA-1

Ход работы:

1. У испытуемого берут кровь в объеме 1-2 мл

2. Каплю крови помещают на стекло прибора, закрывают крышку

3. Проводят измерение в 2 режимах: M(статический) и M1(динамический);

4. Записывают результаты открывают крышку, удаляют кровь спиртовым шариком

5 . Повторяют измерения 3 раза и оценивают среднее значение

Рис. 5 Агрегометр MA-1, фирма «Myrenne».

Биохемилюминесцентный анализ

Основоположник метода биохемилюминесценции А.Г. Гурвич показал возможность передачи информации из одной клетки в другую фотонами электромагнитного поля и высказал гипотезу о существовании в живых системах полей, которые он назвал «биологическими». Факт существования сверхслабого электромагнитного излучения в настоящее время общепризнан и экспериментально обнаружен у всех исследованных клеток растений и животных. Как оказалось, так называемое спонтанное свечение биологических объектов является универсальным свойством живых клеток.

Любая клетка живого организма обладает собственной люминесценцией, которая обязана своим происхождением различным компонентам ее структуры и метаболизма. Свечение, сопровождающее химические реакции, называется хемилюминесценцией. Один из примеров биохемилюминесценции – это свечение, наблюдаемое при взаимодействии органических радикалов, получаемых электрохимическим путем. При взаимодействии радикалов (имеющих противоположный заряд и потому притягивающихся друг к другу) перенос электрона может произойти таким образом, что два электрона окажутся на разных уровнях. Последнее означает, что один из внешних электронов оказывается не на самом нижнем свободном электронном уровне, как у исходных молекул, а на вышележащем электронном уровне. Такая молекула при переходе в основное состояние испускает квант света.

Весь процесс можно разделить на три стадии:

1. Восстановление одного из участников реакции (присоединение электрона) и окисление второго (отрыв электрона). Это приводит к запасанию химической энергии в системе, которая позднее выделится в виде фотона;

2. Перенос электрона (окислительно-восстановительная реакция) не на самый нижний, а на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии;

3. Высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция).

Поскольку каждый элемент люминометра обладает своей спектральной чувствительностью, измеряемое свечение не является истинным. Для того чтобы получить истинный уровень свечения, необходимо внести поправки на чувствительность прибора. В данной работе используется наиболее простой метод получения кривой спектральной чувствительности прибора – измерение свечения вещества с уже известным истинным уровнем свечения. В качестве такого вещества используется эталонный раствор, который помещается в первую ячейку кюветного барабана.

В то же время кровь человека содержит клеточные элементы, размеры, форма и коэффициент преломления которых, меняясь в широком диапазоне, определяют рассеивающие и поглощающие свойства объекта исследования. Это означает, что даже при условии постоянства квантового выхода люминесцирующего вещества получение абсолютных данных о его свойствах по измеренной интенсивности люминесценции – крайне трудная задача. Однако, учитывая, что в данном случае представляют интерес не столько данные об абсолютном уровне свечения, сколько сведения о динамике этого уровня в процессе изменения функционального состояния организма, достаточно постоянства свойств пробы.

При измерениях важно контролировать и изменять условия опыта. Поэтому биохемилюминометр снабжен термостатом, который поддерживает определенную температуру кювет. Отсутствие освещения и постоянная температура в изолированном кюветном барабане позволяют создавать в кювете условия, близкие к физиологическим.

Лабораторная работа №2

Цель: ознакомиться с принципом работы биохемилюминометра БХЛ-3606М, оценить характер люминол-зависимой биохемилюминесценции цельной крови человека в норме.

Приборы и материалы: биохемилюминометр БХЛ-3606М, раствор люминола, 0,9% р-р NaCl, компьютер, термостат, сухие ватные шарики, спиртовые ватные шарики, гепаринизированные капилляры , скарификатор, дозатор.

Ход работы:

1. Произвести забор капиллярной крови (из пальца). Техника взятия капиллярной крови, стандартная: протерев кожу пальца ватным спиртовым шариком, делается прокол индивидуальным стерильным скарификатором. Первую выступившую каплю крови необходимо вытереть, а следующей каплей заполнять гепаринизированный капилляр.

2. Кровь в объеме 75 мкл, хранившуюся не более 6 часов, внести в кювету с 2 мл люминола в физиологическом растворе NaCl 0,9н в барабан биохемилюминометра;

3. Туда же поместить кювету с контрольным раствором. В качестве контроля для измерения фонового свечения, постоянно присутствующего в окружающей среде, используют раствор люминола в физиологическом растворе 0,9н NaCl;

   

4. По полученным графикам свечения рассчитать светосумму за 10 минут с момента наступления стационарной фазы свечения.

Рис. 6 Устройство для оценки биохемилюминесценции. Биохемилюминометр БХЛ-3606М

Спектрофлуориметрический анализ Флуоресценция

Это выделение излучения, обычно света, из вещества, атомы которого получили избыточное количество энергии при бомбардировке частицами, как правило, ультрафиолетового излучения электронов.

Типичное время жизни такого возбужденного состояния составляет 10-11-10-6с.

Флюоресценция прекращается при отсутствии источника энергии, что говорит о необходимости возбуждающего излучения для проведения достоверных исследований.

Длительность пребывания молекул в возбужденном состоянии определяется естественным (радиационным) τ0 и реальным τ1 временем жизни энергетического уровня.

Р еальное время жизни τ определяется вероятностью всех процессов, уменьшающих заселенность возбужденного состояния, т.е.

В ажнейшей характеристикой флуоресценции является ее выход ‒ величина, определяющая долю переходов с испусканием по отношению ко всем процессам, уменьшающим заселенность возбужденного состояния.

Р азличают квантовый выход γ- отношение числа фотонов Nис, испускаемых единицей объема вещества в единицу времени, к числу поглощенных фотонов и энергетический выход Г ‒ отношение испускаемой энергии Uис и поглощенной U:

Флуоресцеин

Ф луоресцентный перенос энергии – это перенос энергии возбужденного состояния от донора к акцептору. Скорость переноса энергии зависит от степени перекрывания спектров испускания донора со спектром поглощения акцептора.

Однако при флуоресцентном переносе энергии никакого промежуточного испускания и поглощения фотона не происходит – в основном, он является результатом диполь-дипольных взаимодействий между донором в возбужденном состоянии и акцептором.

Лабораторная работа №3

Цель: ознакомиться с принципом работы спектрофлуорофотометра Shimadzu RF-5301 и измерить интенсивность флуоресценции.

Основные характеристики прибора:

1. Монохроматор возбуждения 200-700нм,

2. Монохроматор излучения 220-800нм.

3. Спектральное разрешение от 1 до 40нм плавно регулируется изменением ширины щелей монохроматоров.

4. Скорости развертки спектра 12,5, 25, 50, 100, 150, 300 нм/мин.

5. Источник возбуждения ‒ ксеноновая дуговая лампа.

6. В приборе используется 90 градусная схема регистрации флуоресценции.

Ход работы:

В качестве активатора флуоресценции используется флуоресцеин, 5-7 кристаллов которого вносится в кювету с исследуемым образцом и непосредственно перед измерением тщательно перемешивается для лучшего связывания с активными центрами белков крови.

В качестве контроля фонового свечения, используется физиологический раствор NaCl 0,9 н, который подтверждает отсутствие искажений или сигнализирует о необходимой корректировке параметров.

Интерпретация результатов

Правильный результат флуоресцентного анализа может быть получен лишь при учете следующих факторов, сопутствующих эксперименту:

1. Для получения истинных спектров флуоресценции и возбуждения необходимо учитывать зависимость от длины волны спектра излучения источника, пропускания монохроматоров и чувствительности фотоумножителя;

2. На сигнал флуоресценции всегда накладываются сигналы, обусловленные флуоресценцией примесей растворителя, фоновой засветкой, релеевским и комбинационным рассеянием света, рассеянием, обусловленным мутностью раствора, рассеянным излучением, прошедшим через монохроматоры и т.д;

3. Спектр флуоресценции и ее интенсивность могут зависеть от концентрации исследуемого вещества как из-за изменения оптической плотности на длине волны возбуждения, так и из-за межмолекулярных взаимодействий, влияющих на флуоресцентные свойства молекул;

4 . На флуоресцентные параметры исследуемого вещества влияют свойства растворителя (его полярность, вязкость, pH наличие растворенных веществ).

Рис. 7 Shimadzu RF-5301