• Окрашивание гистологических препаратов

Окрашивание срезов позволяет выявлять разнообразные микроструктуры клеток и тканей, повышать их контрастность. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).

Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Микроструктуры, отличающиеся по своим физико-химическим свойствам, по-разному воспринимают красители, среди которых различают основные, кислые и нейтральные.

1. Основные красители — красящие соли оснований (гематоксилин, метиловый синий, толлуидиновый синий, азуры, тиоиин. и т. д.), связываясь с кислотными соединениями гистологических структур, вызывают их контрастирование окрашиванием в цвета синего. Структуры, воспринимающие основные красители, называют базофильными.

2. Кислые красители (пикриновая кислота, эозин, эритрозин, коигорот, лихтгрюн, оранж и т. д.), связываясь с основными соединениями гистологических структур, вызывают их контрастирование окрашиванием в цвета красителя (красного, желтого, оранжевого, зеленого). Интенсивность окрашивания зависит от условий фиксации и количества прореагировавшего с красителем вещества. Структуры, воспринимающие кислые красители, называют оксифильными.

3. Нейтральные красители содержат как основные, так и кислые красящие компоненты. Структуры, воспринимающие нейтральные красители, называют нейтрофильными. Импрегнация — метод выявления структур клеток и тканей, основанный на различной их способности удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов (серебро, свинец, осмий, золото).

Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Гейденгайну) и 1-2% эозином. Это позволяет детально рассмотреть ядерные и цитоплазматические структуры, хотя и не выявляющие химического состава.

Способ окрашивания прогрессивный, т.е. заключается в перекрашивании объекта и образования на клеточных и тканевых структурах гематеинового лака (продукт реакции гематоксилина с железо-аммонийными квасцами). В ходе последующего дифференцирования (ослабления) до желаемого тона избыток лака удаляется. При дифференцировании стекло помещают в 2,5-3%-й раствор железоаммонийных квасцов, переодически вынимают и споласкиваю водой, контролируя процесс под микроскопом при разных увеличениях. Дифференцирование продолжается до момента, когда исследуемые структуры становятся отчетливо различимы. После промывки препарата срезы можно докрасить 1%-м раствором эозина, который придает розоватый цвет цитоплазматическим структурам.

Техника окрашивания:

1. Удаляют парафин из срезов в орто-ксилоле или толуоле, проводят по спиртам нисходящей концентрации и доводят до воды (две порции ксилола или толуола – 3-5 минут, 96° этанол – 3 минуты, 80° этанол – 3 минуты, 70° этанол – 3 минуты, дистиллированная вода – 5 минут).

2. Окрашивают гематоксилином 7-10 минут (в зависимости от зрелости красителя).

3. Промывают в дистиллированной воде – 5 минут.

4. Дифференцируют в 1% соляной кислоты на 70° этаноле до побурения срезов.

5. Промывают дистиллированной водой, а затем слабым (0,5 %) раствором аммиака до посинения срезов.

6. Окрашивают водным раствором эозина 0,5-1 минуту (в зависимости от желаемой окраски).

7. Промывают в трех порциях дистиллированной воды для удаления избытка эозина.

8. Удаляют воду из срезов в одной порции 70° этанола, двух порциях 96° этанола. Экспозиция в каждой порции спирта – 2 минуты.

9. Просветляют срезы в двух порциях карбол-ксилола (смесь расплавленного фенола и ксилола либо толуола в соотношении 1:4 или 1:5) – 1 минута.

10. Производят окончательное обезвоживание срезов в двух порциях ксилола или толуола. Пребывание срезов 2 минуты.

11. Заключают срезы в канадский бальзам или синтетическую среду (Вio Мount, Synthetic Mountant др.) для заключения гистологических срезов.

П ри заключении под покровное стекло важно добиться отсутствия на препарате пузырьков воздуха и участков без заливочной (монтировочной) среды. Для этого необходимо равномерно наносить среду на препарат, плавно и медленно с одного края опускать покровное стекло, используя препаровальную иглу. После заключения препарата под покровное стекло его переносят в термостат (37 °С) где он хранится несколько суток до полного высыхания. Окрашивание также можно автоматизировать, проводя его в аппарате для окраски гистологических препаратов.

Рис. 1.6 Окрашенный срез гематоксилин-эозином

Рис. 1.7 Мультистейнер DRS 2000