РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Институт биологии

ОТЧЕТ

по учебной практике по дисциплине «Эмбриологии»

(с 04.07.2015 по 18.08.2015 г.)

Студента II курса

38БиБ136 группы

___________________

ЗВЕНО 3

ФИО

Руководитель практики

____________________

д. б. н., профессор Елифанов А.В

Тюмень, 2015

Оглавление:

Цели и задачи практики: 3

Содержание практики: 4

1. Методы гистологического и эмбриологического исследования: 4

Микроскопия 4

Приготовление гистологических объектов 8

Окрашивание гистологических препаратов 11

Анализ изображения клеточных и тканевых структур 13

2. Сбор фактического материала: 15

Особенности эмбриогенеза рыб. Некоторые цитометрические показатели. Формирование нейромышечного комплекса. 15

3. Анализ полученных результатов: 22

Список литературы: 24

.

Цели и задачи практики:

Сроки практики: с 04.07.2015 по 18.08.2015 года

Место прохождения практики: лаборатория световой микроскопии кафедры анатомии и физиологии человека и животных Института биологии ТюмГУ

Цели практики: закрепление и углубление теоретических знаний в соответствии с требованиями ГОС ВПО и ОС НГУ к уровню подготовки обучающихся, приобретения необходимых практических умений и навыков научно-исследовательской работы. В ходе практики студент обучается:

- работать с оригинальной научной литературой;

- использовать современную аппаратуру, приборы и специальное лабораторное оборудование;

- обрабатывать и оформлять полученные результаты;

- готовить и осуществлять публичное выступление.

Задачи практики:

Для достижения поставленной цели выделяются задачи курса:

1. Получение навыков приготовления гистологических препаратов с использованием методов, соответствующим поставленным задачам исследования.

2. Получение навыков анализа гистологических препаратов и сопоставления полученных результатов с ранее опубликованными в научной литературе.

3. Получение навыка осуществления поиска необходимого по теме опубликованного материала в библиотеках РАН.

4. Получение навыка написания научного отчета.

Содержание практики:

1. Методы гистологического и эмбриологического исследования:

• Микроскопия

Основными методами исследования гистологических объектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в клинической и экспериментальной практике. В настоящее время эти методы нашли целый ряд дополнений и модификаций, что значительно расширило круг задач и вопросов.

1. Оптическая система микроскопа включает объектив и окуляр.

Объектив (5) — это система линз, которая присоединяется к тубусу (7) снизу и непос­редственно направляется на объект. Обычные увеличения объектива: х8, х20, х40 (сухие объективы), х100 (иммерсионный объектив).

При использовании иммерсионного объек­тива его погружают в каплю кедрового масла, нанесенную на покровное стекло препарата. Окуляр (6) вставляется в тубус сверху. При­меняются окуляры с увеличением х7, х10, х15.

Результирующее увеличение микроскопа — это произведение увеличений объектива и окуляра, например: 20 х 10 = 200 раз. Таким образом, функция оптической сис­темы — формирование увеличенного изоб­ражения объекта на сетчатке глаза наблюда­теля.

Рис. 1.1 Световой микроскоп и ход в нем лучей света.

Световой микроскоп (Рис. 1.1) имеет три системы: оптическую, осветительную и механическую.

Разрешающая способность (d) — минимальное расстояние между двумя точками объекта, которые видны раздельно.

;

— длина волны света, в котором наблюдается объект; n — показатель преломления среды между объектом и объективом; — угол между оптической осью объектива и наиболее отклоненным лучом, попадающим в объектив.

2. Осветительная система микроскопа вклю­чает источник света, зеркало, диафрагму и конденсор.

Источник света (1) может быть встроен в микроскоп либо находиться вне микроско­па (пример — обычная настольная лампа). Иногда удается проводить микроскопическое исследование при естественном дневном ос­вещении. Зеркало (2) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу. Одна по­верхность зеркала — плоская, она использу­ется при естественном (дневном) освеще­нии, поскольку лучи, падающие при этом на зеркало, параллельны друг другу. Вторая поверхность — вогнутая; она собирает лучи, расходящиеся от искусственного источни­ка света. Диафрагма (3)представляет собой систе­му непрозрачных пластинок с отверстием по­середине. Она ограничивает световой поток, падающий на препарат. При использовании объективов с большим увеличением отверс­тие диафрагмы следует уменьшить — для ос­лабления сферической аберрации. Конденсор (4) состоит из линз, которые фо­кусируют лучи света на препарате. Подни­мая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей. Иног­да диафрагма вмонтирована в конденсор.

3. Механическая система микроскопа — ту­бус (7), штатив (8), колонка (9) и предметный столик (10).

С колонкой связаны макро- и микромет­рический винты. Они поднимают и опускают колонку с тубусом для фокусировки изобра­жения объекта на сетчатке глаза наблюдате­ля. Макровинт используется при работе на ма­лом увеличении, а микровинт — на большом.

Рис. 1.2 Микроскоп проходящего света Zeiss «Axio Imager»

Рис. 1.3 Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM-510

Для получения качественного изображения с целью полноценного анализа и фотографирования гистологических препаратов, необходимо произвести настройку освещения. Одной из важных причин искажения изображения являются колебания яркости вследствие неоднородности освещенности в центре и по краям поля зрения затеняющие дефекты проявляются в виде кольцеобразной тени, темнеющей ближе к краям изображения. Чтобы обеспечить равномерное освещение, достичь максимального разрешения микроскопа (Рис. 1.2) и получить качественное, резкое и контрастное изображение, следует произвести его настройку по Келеру. Для этого выполняются следующие операции:

1. Получить резкое изображение образца с помощью объектива 10х

2. или большего увеличения, так, чтобы видеть хотя бы какой-нибудь участок в фокусе.

3. Закрыть полевую диафрагму на выходе светового пучка.

4. Перемещать конденсор вверх-вниз, пока в плоскости образца

5. не появится изображение закрытой полевой диафрагмы. Теперь освещена только центральная часть поля видения

6. Если освещаемая часть образца находится не в центре, конденсатор необходимо отцентрировать, перемещая его винтами в направлении XY.

7. Затем отрегулировать высоту конденсатора так, что бы края полевой диафрагмы были резко видны и дифракционный цвет на краю полевой диафрагмы был сине-зелеными, обращенным за край диафрагмы ( не в поле зрения!).

8. Открыть полевую диафрагму настолько, что бы все

9. поле видения было освещено (может потребоваться дополнительная центровка в направлении XY).

10. Что бы получить наилучший контраст при ныблюдении поля с высокой освещенностью, открыть апертурную диафрагму конденсатора на 80% от числовой апертуры объектива. Что бы напрямую видеть апертурную диафрагму, один из окуляров вынимают из окулярной трубки.

При документировании числовая апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива.

Предметный столик на многих микроскопах может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет рассматривать различные участки препарата.

Поскольку микроскопическое исследование проводится в проходящем свете, препарат должен быть достаточно тонким. Заметим также, что микроскоп дает перевернутое изображение объекта

Электронная микроскопия — это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1—5 Å).

Действие электронного микроскопа основано на использовании направленного потока электронов, который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).

Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз. В биологии и медицине в основном используются электронные микроскопы просвечивающего типа.

Конфокальный микроскоп — оптический микроскоп (Рис. 1.3), обладающий значительным контрастом по сравнению с обычным микроскопом, что достигается использованием апертуры, размещённой в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света.

Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Метод основан на том, что свет, проходя структуры с различным коэффициентом преломления, изменяет свою скорость. Используемая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменения его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе.