18. Общая характеристика векторов для экспрессии чужеродных белков в E. coli. (общий вопрос, рассмотрен ранее).

19. Регуляция экспрессии лактозного оперона.

Оперон – это единица координированной транскрипции генов прокариот. В лактозном опероне E. Coli закодировано несколько ферментов, участвующих в метаболизме бактерии, а конкретно в усвоении лактозы (в клетке E. Coli лактоза расщепляется на глюкозу и галактозу). Чтобы лучше понять регуляцию экспрессии оперона, нам необходимо рассмотреть его строение:

1. Лактозный оперон E. Coli это участок ее генома, в котором есть промотор и терминатор для начала и конца синтеза маточной РНК соответственно.

2. Внутри оперона находятся три структурных гена lacZ, lacY и laсA, кодирующих β-галактозидазу, β-галактозидперпермеазу, β-галактозидтрансацетилазу.

3. Сразу после промотора находится оператор (участок связывания с белком репрессором)

4. Перед лактозным опероном находится еще один один оперон, состоящий из промотора, гена lacI, кодирующего белок-репрессор и терминатора.

Рисунок 2.1 Строение лактозного оперона

Негативная регуляция. При отсутствии или низкой концентрации лактозы в клетке, белок-репрессор связывается с оператором и препятствует транскрипции. В отсутствие лактозы в клетке ферменты расщепления лактозы не вырабатывются. При попадании лактозы в клетку, ее молекулы связываются с белком-репрессором, что приводит к изменению его конформации и диссоциации от оператора. Транскрипция генов лактозного оперона становится возможной, оперон активирован. При снижении концентрации лактозы в клетке, новые порции белка-репрессора связываются с оператором и блокируют синтез ферментов.

Позитивная регуляция: если в клетке концентрация глюкозы достаточно высока для поддержания метаболизма, активация лактозного оперона не происходит, так как отсутствсия белка-репрессора недостаточно для начала транскрипции. Однако, если концентрация глюкозы снижается, происходит активация фермента аденилатциклазы, которая катализирует превращение АТФ в циклическую форму – цАМФ (cAMP). Происходит связывание цАМФ с белком, активирующим катаболизм (CAP) и образуется комплекс сAMP-CAP, взаимодействующий с промотором лактозного оперона и изменяющим его конформацию, что приводит к увеличению сродства РНК-полимеразы к промотору. Происходит экспрессия генов.

20. Современные способы получения инсулина.

В настоящее время используются два способа промышленного производства препаратов для диабетиков:

— ферментативная обработка свиного инсулина,

— генно-инженерный.

Гормон у свиней отличается от человеческого всего на одну аминокислоту – вместо треонина присутствует аланин. Поэтому чтобы придать ему структуру человеческого, производят химическую модификацию животного сырья. В процессе химической реакции отщепляют аланин и присоединяют треонин.

При генно-инженерном способе для выпуска средства используются генетически измененные микроорганизмы (бактерии, дрожжи). Имеются два варианта производства подобного инсулина.

Первый вариант предполагает применение двух штаммов какого-то микроорганизма. Каждый из штаммов синтезирует одну цепь молекулы ДНК. Потом две цепи соединяются, после чего из раствора выделяются активные формы инсулина.

Суть второго варианта состоит в том, что микроорганизм сначала производит проинсулин. После обработки ферментами проинсулин превращается в активный гормон.

В инсулиновых препаратах, если они не прошли надлежащую очистку, могут присутствовать различные примеси, способные вызывать нежелательные побочные эффекты.

К таким примесям относятся проинсулин, белки, глюкагон и т.д. Современные технологии очистки, при их соблюдении, позволяют производить очищенные (монопиковые) и высокоочищенные (монокомпонентные, кристаллизованные) инсулины.

21. Стратегия очистки белков. Выбор методов разделения для очистки белков. Типичная схема очистки белка. Основные параметры (выход, степень очистки), характеризующие процесс очистки. Представление хода очистки белка.

ДЛЯ ПОЛНОГО ПОНИМАНИЯ ВОПРОСА СОВЕТУЕТСЯ ПРОСМОТРЕТЬ (И ПРОСЛУШАТЬ) ПРЕЗЕНТАЦИЮ 4

Стратегия очистки белков. (през. 4.5. слайд 1)

Схема включает 4 стадии:

Подготовка – разрушение биологического материала, извлечение белка и удаление нерастворимой части

«Захват» - перевод белка в стабильную форму, концентрирование раствора,

Промежуточная стадия очистки – удаление основной массы примесей (80-90% содержания основного белка в растворе)

Финальная очистка – доведение до необходимых параметров конечного продукта

Выбор методов разделения для очистки белков

Три основных свойства белка, которые лежат в основе разделения белка: заряд, гидрофобность/гидрофильность, размер. В зависимости от свойств отделяемого белка применяют следующие методы разделения (подробно о каждом в вопросах 22-27, 32) или в презентациях 4.2.-4.4)

Типичная схема очистки белка. Представление хода очистки белка.

(през. 4.5, слайд 4)

Основные параметры (выход, степень очистки), характеризующие процесс очистки. (през. 4.5., слайд 5 – внятно на цифрах объясняет)

Выход – доля целевого вещества на выходе относительно его на входе (т.е. то количество белка, которое осталось после очистки по отношению к тому, которое было загружено перед ней. Выражается в %)

Степень очистки – отношение доли целевого белка, полученного ПОСЛЕ очистки, к изначальной доле целевого белка в препарате ДО его очистки.