-
Клонирование в космидах, фазмидах.
Векторы на основе фага лямбда. ДНК фага лямбда - это линейная двухцепочечная молекула размером около п.о. с одноцепочечными 5-концами из 12 нуклеотидов. Их называют cos- концами (cos-сайтами), они взаимокомплементарны и могут спариваться друг с другом с образованием кольцевой молекулы. В зрелых вирионах ДНК находится в форме линейной молекулы, попадая в клетку, ДНК циклизуется по соs-сайтам и функционирует в кольцевой форме. Преимущество использования фага лямбда перед плазмидами в том, что можно клонировать до 20 кб чужеродной ДНК. Эффективность внедрения рекомбинантных фагов составляет 100% в отличие от трансформации, при которой эффективность внедрения ДНК составляет
КОСМИДА = COS-САЙТ + ПЛАЗМИДА
Космиды – это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага λ (Cos-сайт), обеспечивающий упаковку этой ДНК в фаговую частицу.
Космиды могут амплифицироваться как плазмидный вектор в клетках E. coli и быть нагруженными до 40 кб чужеродной ДНК. В космидный вектор можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК (40 кб) по сравнению с плазмидным или фаговым вектором, поскольку собственная ДНК космидного вектора мала, около 10 кб и способна эффективно доставлять рекомбинантную ДНК с помощью фага лямбда. По этой причине космиды используют при клонировании геномной ДНК эукариот
Рисунок 1 -картинка из лекции. не очень понятная, ниже поннятнее на мой взгляд
С помощью космид можно клонировать участки ДНК размером 32-47 т.п.н. Для этого космиду и чужеродную ДНК обрабатывают одной и той же эндонуклеазой рестрикции, после чего полученные линейные фрагменты смешивают и проводят реакцию лигирования. Далее происходит упаковка ДНК в фаговые головки in vitro, она разрезается в cos-участках. Необходимые вирусные белки получают из лизата E.coli cI857 (red- gam- Sam и Dam (головка) и Eam (хвост)). Этот процесс сопровождается селекцией фрагментов по размеру, поскольку упаковываться может только ДНК длиной 78-105 % от генома фага лямбда. Таким образом в вирионы попадут преимущественно рекомбинантные космиды, содержащих клонированный участок ДНК. Продукты лигирования между двумя космидами будут слишком малы для упаковки, а между двумя фрагментами чужеродной ДНК — велики.
Полученные фаговые частицы с рекомбинантными космидами используют для инфицирования клеток кишечной палочки. В цитоплазме космиды циклизуются благодаря соединению липких концов и действию фермента лигазы, а далее реплицируются как обычные плазмиды, не проявляя никаких свойств фага лямбда. Селекция трансформированных клеток проводится по маркерным геном, присутствующим в векторной молекуле.
ФАЗМИДА = ФАГ + ПЛАЗМИДА
Фазмиды (фагмиды) – это векторы, являющиеся гибридом между фагом и плазмидой и способные после встраивания чужеродной ДНК существовать и как фаг, и как плазмида.
Фазмиды после встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, а в других как плазмиды. Исходно фазмида имеет размер до 30 кб. В ее состав входит до 70% генома фага, включая coscайты и ori- последовательность фага. Применение фазмидных векторов значительно упрощает процедуру получения и отбора рекомбинантных векторов, поскольку только рекомбинантные фазмиды образуют на бактериальном газоне фаговые бляшки. В отличие от космидной или фаговой векторных систем, фазмидный вектор существует в клетке в виде плазмиды, а клонотека хранится в виде суспензии гибридных фагов
Размер λpMYF131 таков, что она не может эффективно упаковываться в фаговые частицы. Упаковка становится возможной после встройки чужеродной ДНК. Размер клонируемого фрагмента около 15 тпн.
Для поддержания фазмиды в клетках в виде плазмиды используют штаммы E. Coli лизогенные по фагу λ. Такие штаммы продуцируют фаговый белок-репрессор cI, подавляющий развитие фага по литическому пути. Для перевода фазмиды в фаговую форму меняют условия культивирования (например, повышают температуру) или используют другой штамм.
