12. Методы сайт-направленного мутагенеза с использованием пцр.

Этот принцип основан на том, что мы можем использовать не комплементарные праймеры. Если мы исползуем праймеры в которых один или несколько олигонуклеотидов не комплементарны нашей матричной цепи, то в каждой молекуле вновь синтезированной ДНК оказывается эта мутация. Нужно лишь позаботится о том, что бы этот праймер имел достаточное сродство к матрице и ПЦР шла селективно. Могут быть разные варинты модификации:

-Либо отличающийся олигонуклеотид внутри прймера, как на слайде

-Либо висячий хвот, как справа на слайде.

Нам обычно нужно модифицировать некий участок внутри молекулы ДНК, используя праймер мы вносим модификацию на один из концов молекулы ДНК. Хоть сейчас праймеры могут быть достаточно большими, но протяженность тех молекул куда нам нужно вносить модификации гораздо больше, поэтому приходится находить какие-то новые методы.

2 метода:

Мегапраймерная схема.

Есть участок ДНК, который мы собираемся модифицировать.

Мы должны выбрать рядом с этой мутацией сайты рестрикции (R1 и R2 на слайде) (по которым потом мы будем переносить модифицированный фрагмент ДНК обратно)

Дальше мы выбираем один из праймеров (с одним праймером нам трудно что-то сделать, тк это праймер к тому месту куда мы ходим внести модификацию [кружок это и есть не комплементарный участок ДНК, где потом в модифицированной цепи будет мутация]), а второй праймер мы выбираем так, чтобы он находился за сайтом рестрикции R2 , чтобы потом полученный амплифицированный фрагмент ДНК содержал этот сайт рестрикции R2.

Затем проводится ПЦР1, получаем модифицированный фрагмент, в котором с одной стороны есть сайт рестрикции, а с другой стороны соответствующая мутация.

Теперь что бы этот фрагмент перенести обратно в цепь ДНК, нам нужно его достроить. Можно использовать подход, который заключается в применении именно этого фрагмента, как мегапраймера. То есть снова берем изначальную цепь ДНК, теперь уже берем мегапраймер с одной стороны, и с другой стороны берем праймер так, чтобы он снова находился за сайтом рестрикции R1­. (вторая цепь работать не будет, потому что не будет амплификации. Амплификация в ПЦР проходит только тогда, когда есть 2 праймера, которые фланкируют область, которую мы амплифицируем и именно это приводит к экспоненциальному росту количества ДНК. В случае же если праймер один, то после ПЦР получается всего одна молекула)

После ПЦР2 у нас получилась одна молекула, но она содержит мутацию и фланкированную двумя сайтами рестрикции, по которым мы можем вернуть необходимый фрагмент ДНК в исходную молекулу.

Этот метод часто используется, но мегапраймер не всегда эффективно работает и сейчас наибольшее распространение получил второй метод.

ПЦР с достройкой перекрывания (overlap extension PCR)

Начинается все так же, мы хотим ввести мутацию, значит мы должны выбрать сайты рестрикции (R1 и R2 на слайде), мы делаем первые 2 праймера, (все тоже самое) один с мутацией, другой стоит после R2, происходит ПЦР1 и образуется новый фрагмент.

Тоже самое делаем с другой стороны, чтобы получить фрагмент, содержащий R1.

Смысл в том, что полученные фрагменты в ПЦР1 и ПЦР2 должны перекрываться. И эти участки, содержащие мутацию в обоих случая полностью идентичные.

После этого полученные фрагменты денатурируются и отжигаются. Получается, что эти две одиночные цепи будут взаимодействовать.(стрелочки показывают , что это одноцепочечные молекулы ДНК). И после этого от 3` конца идет достраивание цепи по второй с помощью ПЦР. (в две стороны и снизу, и сверху). Получаем полную цепь содержащую мутацию и фланкированную двумя сайтами рестрикции.

После этого мы добавляем 2 праймера, до R1 и после R2 , и производим амплификацию.

Оба метода широко используются и позволяют получать модифицированные ДНК очень эффективно.

13. Методы трансформации E. coli (использование протопластов, Са++-зависимый метод, использование положительно-заряженных полимеров и липосом, электропорация, упаковка ДНК в капсид фага  in vitro).

Определение трансформации вопрос №3.

Использование протопластов:

Исторически первым подходом к получению компетентных для трансфекции (трансформации) клеток бактерий является ферментативный гидролиз клеточных стенок, приводящий к удалению физического барьера на пути проникновения молекул ДНК в клетку. Для этой цели можно использовать различные индивидуальные ферменты (например лизоцим) или смеси ферментов (например пищеварительный сок виноградной улитки). При ферментативной обработке клетки необходимо помещать в изотонический раствор (0,2 М сахароза; 1 М сорбит;B 0,6 М КСI и др.), имеющий примерно такое же осмотическое давление, какое характерно для цитоплазмы клетки. В этих условиях клетки, лишенные своего жесткого «панциря» (клеточной стенки), приобретают шарообразную форму и не лопаются от осмотического шока, наблюдаемого в гипотонической среде. В том случае, когда после гидролиза полностью удаляется клеточная стенка и остается только плазматическая мембрана, ограничивающая содержимое клетки, возникает осмотически чувствительный протопласт.

При получении протопластов большое значение имеет подбор условий, обеспечивающих в последующем эффективную регенерацию клеточных стенок. Процедуры получения протопластов, трансформации их молекулами ДНК, регенерации клеточной стенки и отбора колоний трансформантов многоэтапны, а результат зависит от многих параметров: состава растворов, способов обработки и др. Все это приводит к тому, что данные методики отличаются низкой воспроизводимостью, требуют высокой квалификации исполнителя и весьма трудоемки.

*Протопласт бактерии (то есть бактерия без клеточной стенки) может быть трансформирована любыми известными способами + посредством слияния протопластов.

Подробнее:

Са++-зависимый метод

Механизм индукции компетентного состояния клеток Е. coli, обусловленной ионами кальция, наиболее подробно был исследован на примере плазмидной трансформации. Выяснилось, что в этом процессе критическую роль играет состояние липидов внешней мембраны клеток. Ионы Са2+ (в меньшей степени Ва2+ и Мg2+) могут индуцировать фазовый переход липидов мембраны, благодаря чему она приобретает вместо обычной двухслойной необычную гекcaгональную конфигурацию. Причем данный фазовый переход происходит во время температурного шока обработанных хлоридом кальция клеток и сопровождается поглощением экзогенных двухцепочечных молекул ДНК. Температура фазового перехода строго зависит от липидного состава мембраны. На одном из штаммов Е. сoli было показано, что при тепловом вызванном переносом обработанных СаCl2 клеток с температуры 0 °С на 42 °C, поглощение молекул ДНК продолжается в течение лишь 20 с. Если после этого смесь клеток и ДНК снова резко охладить до температуры 0 °С, то в процессе индуцируемого фазового перехода липидов молекулы ДНК снова могут проникать в клетки. При этом период проникновения ДНК более продолжителен. Фазовые переходы липидов приводят к нарушению структуры внешней мембраны, но практически не затрагивают плазматическую мембрану клеток Е. сoli. Необходимо отметить, что через плазматическую мембрану молекулы ДНК способны проникать без теплового шока и бивалентных катионов.

Упаковка ДНК фага лямбда в капсиды In vitro

Для фага λ, часто используемого в качестве молекулярного вектора клеток Е. сoli, pазработан метод упаковки ДНК in vitro в капсиды. Для этого требуются концентрированные экстракты клеток, индуцированных из лизогенного состояния. Используются мутанты фага, имеющие дефекты по разным генам белков головки капсида. Каждый из таких мутантов не способен образовывать полноценные фаговые частицы и упаковывать свою ДНК. При смешении же фаговой ДНК и белковых экстрактов клеток, в которых развивались мутанты, происходит комплементация недостающих функций и собираются инфекционные частицы. Биологическую активность эндогенной фаговой ДНК в экстрактах обычно подавляют УФ-облучением. Сформированными in vitro частицами можно заражать клетки Е. соli и получать фаговое потомство. Эффективность упаковки ДНК фага λ in vitro oбычно составляет 10-2-10-3. Важной особенностью данного подхода является то, что в капсид преимущественно упаковываются молекулы фаговых ДНК, имеющие размер, близкий к размеру фагового генома. Это позволяет после реакции лигирования фрагментов осуществлять селекцию гибридных молекул ДНК in vitro по размеру. Кроме того, в капсиды не упаковываются многочисленные побочные продукты лигазной реакции. Поэтому образовавшиеся после упаковки фаговые частицы инъецируют в бактериальные клетки лишь фаговые ДНК заданного размера. При клонировании фрагментов в векторных молекулах ДНК фага λ обычно используют именно этот метод введения гибридных ДНК в клетку. Данный прием также необходим при клонировании фрагментов ДНК в составе космид и фазмид.

Подробнее про фаг лямбда вопрос №16.

Электропорация

Суть данного подхода состоит в том, что кратковременное воздействие (обычно 5-20 мс) электрического поля высокой напряженности (1-15 кВ/см) на клеточную мембрану приводит к образованию в ней пор (электропробой). Время существования и размер пор достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы добиться высокой частоты поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80 % выживших клеток. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому для эффективного поглощения ДНК мелким бактериальным клеткам требуется значительно большая напряженность электрического поля (10 кВ/см и более), чем крупным животным и растительным клеткам (1-2 кВ/см).